Proteínas recombinantes ligadas a TAT e sua aplicação terapêutica na reversão de dano isquêmico de ilhotas pancreáticas : impacto em transplante

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007.O transplante de ilhotas pode ser uma opção para o tratamento do Diabetes do tipo I em função do aumento do controle metabólico e da qualidade de vida do paciente transplantado. As maiores limitações para a aplicação dessa técnica em larga escala são o alto número de ilhotas necessárias para a obtenção de um bom funcionamento do transplante e a deteriorização de ilhotas, causados por dano isquêmico por preservação a frio. Aqui propomos o uso de nova tecnologia denominada TAT- PTD como transportador de moléculas terapêuticas para o interior de ilhotas e pâncreas com a intenção de prevenir morte de ilhotas, aumentando, assim, o número e a qualidade das ilhotas para transplante de pacientes diabéticos. Resultados da Parte I: Construímos uma proteína de fusão composta por Heme oxigenase -1 (HO1) e o domínio de transdução protéica TAT- PTD (TAT) um peptídeo viral com 11 aminoácidos provenientes do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e com capacidade de penetrar em membrana plasmática. A transdução de TAT-PTD-HO1 em células produtoras de insulina protege contra a ação citotóxica de TNF-α. A transdução de TAT-HO1 para o interior de células produtoras de insulina não danifica a fisiologia de ilhotas como foi mostrado quando estas são transplantadas em camundongos imunodeficientes e com Diabetes quimicamente induzida. Finalmente, mostramos que transdução de ilhotas com a proteína de fusão melhora a viabilidade de ilhotas em cultura. Essa abordagem pode ter um impacto positivo no aumento da disponibilidade de ilhotas para transplante. Resultados da Parte II: A produção de proteínas de fusão ligadas a TAT-PTD pode ser obtida em larga escala e eficientemente com a expressão protéica em E. coli. No entanto, a contaminação com endotoxina representa um problema para a aplicação dessas proteínas in vitro e in vivo. Desenvolvemos várias proteínas de fusão ligadas a TAT que têm aplicação terapêuticas em ilhotas. Apresentamos aqui um novo método para a eficiente remoção de endotoxina de soluções protéicas usando tubos de polipropileno em combinação com tratamento em pH ácido, mantendo a atividade biológica da proteína com bom rendimento protéico. Resultados da Parte III: Para poder detectar possíveis moléculas que possam ser citoprotetoras e que possam ser associadas à tecnologia de TAT-PTD, estabelecemos um modelo de isquemia a frio em pâncreas de ratos. Isso nos permitiu estudar a modulação de vias ativadas por sinal de stress que levam ao impedimento da recuperação da qualidade e função de ilhotas. Observamos que JNK e p38 são proteínas kinase ativadas por stress (SAPK) que estão presentes por causa de dano causado por isquemia pancreática e isolamento de ilhotas. Um experimento preliminar usando TAT-D-JNKi, inibidor de JNK, tentou prevenir dano causado pela ativação de JNK. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTIslet transplantation can become a therapeutic option for the treatment of Type I Diabetes due to increased metabolic control and quality of life for transplanted patients. The major limitations for widespread application of this technique are, high number of islets needed to attain good function after transplantation and islet deterioration caused by pancreatic injury through cold ischemia storage. We here propose the use of a new technology using TAT-PTD as a transporter of therapeutic molecules into islets/pancreas with the attempt to prevent islet cell death and increase islet number/quality for transplantation of diabetic patients. Results from Part I: We have generated a fusion protein composed of HO-1 and TAT protein transduction domain (TAT/PTD), an 11-aa cell penetrating peptide from the human immunodeficiency virus TAT protein. Transduction of TAT/PTD–HO-1 to insulin producing cells protects against TNF-a-mediated cytotoxicity. TAT/PTD–HO-1 transduction to islets does not impair islet physiology, as assessed by reversion of chemically induced diabetes in immunodeficient mice. Finally, we report that transduction of HO- 1 fusion protein into islets improves islet viability in culture. This approach might have a positive impact on the availability of islets for transplantation. Results from Part II: While production of TAT-PTD-bound protein can be efficiently attained by E. coli protein replication, contamination with endotoxin represents a major hindrance for application of these proteins in the context of in vitro and in vivo testing. We have developed several TAT-attached proteins that have therapeutic cytoprotection applications on islet. Here we present a novel method for efficient removal of endotoxin from proteins in polypropylene tubes in combination with acidic pH treatment that does not interfere with biological activity of the protein and has good protein recovery. Results from part III: In order to identify possible molecular targets for islet cell cytoprotection by TAT-PTD technology, we have established a rat pancreas cold ischemia model and readout systems allowing for the study of the modulation of stress-activated cellular pathways leading to impairment of islet cell recovery and quality. We have observed that JNK and p38 stress activated protein kinases (SAPKs) are activated as a result of pancreas ischemia and islet isolation. A preliminary experiment was done using TAT-D-JNK inhibitor to try to prevent or reduce islet damage caused by activation of this SAPK pathway using this stringent model system