Avaliação da expressão e caracterização de uma exo-ß-1,3-glucanase envolvida no mecanismo de micoparasitismo de Trichoderma asperellum

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008.Espécies do gênero Trichoderma têm sido encontrados atacando uma grande variedade de fungos patogênicos e usados como agente de biocontrole. A maioria das preparações a base de Trichoderma, utilizadas comercialmente para controle biológico, são de Trichoderma atroviride ou Trichoderma harzianum. Entretanto, Trichoderma asperellum, uma espécie pouco estudada, é um efetivo agente de controle biológico contra alguns fungos patogênicos. A interação de T. asperellum com Rhizoctonia solani é característica de micoparasitismo, envolvendo crescimento em direção ao hospedeiro, produção de estruturas semelhantes à apressórios e enrolamento das hifas. A maioria dos fungos fitopatogênicos possui parede celular contendo quitina, organizada em camadas regularmente ordenadas e ß-1,3-glucanas arranjadas como um enchimento de maneira amorfa. Quitinases e ß-1,3-glucanases tem sido diretamente envolvidas nas interações de micoparasitismo entre espécies de Trichoderma e seus hospedeiros. Neste trabalho nós apresentamos a análise da expressão de exo-ß-1,3-glucanases produzidas por T. asperellum durante o crescimento em diferentes fontes de carbono. Também demonstramos que a expressão do gene tag83 ocorre quando o T. asperellum cresce sob simulação de antagonismo contra R. solani. Estudamos a regulação do gene codante da exo-ß-1,3-glucanase extracelular (tag83) produzida pelo micoparasita T. asperellum. Foi detectada atividade enzimática em todas as fontes de carbono avaliadas, com níveis elevados encontrados quando amido e parede celular de R. solani foram utilizados. Estes resultados são apoiados pela presença de uma forte banda com atividade enzimática em gel nãodesnaturante (PAGE). Experimentos utilizando RT-PCR demonstrou que a indução da exo-ß-1,3-glucanase em T. asperellum ocorrem em nível transcricional. Também utilizamos RT-PCR e PCR em tempo real para analisar a expressão do gene tag83 durante ensaio in vivo do T. asperellum contra R. solani. Demonstramos ainda que a expressão de tag83 está significativamente aumentada na presença de R. solani. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTSpecies of the genus Trichoderma have been found to attack a wide range of plant-pathogenic fungi and have been used as biocontrol agents. The majority of Trichoderma preparations used commercially for biological control are Trichoderma atroviride or Trichoderma harzianum. However, Trichoderma asperellum, a less well studied species, is also an effective biological control agent against some phytopathogen fungi. The interaction of T. asperellum with Rhizoctonia solani is characteristically mycoparasitic, involving growth along the host hyphae, production of appressoria-like structures and coiling. Most phytopathogenic fungi have cell wall that contain chitin as a structural backbone arranged in regularly ordered layers and â-1,3-glucan as a filling material arranged in an amorphous manner. Chitinases and â-1,3-glucanases have been found to be directly involved in the mycoparasitism interaction between Trichoderma species and its hosts. In this study, we reported the analysis of expression of the exo-ß-1,3-glucanase encoding gene tag83 produced by T. asperellum during growth in different carbon sources. We also show that expression of tag83 gene occurs when T. asperellum grows under simulated antagonism against R. solani. The regulation of the gene encoding the extracellular exo-â-1,3-glucanase (tag83) produced by the mycoparasite Trichoderma asperellum was studied. Enzyme activity was detected in all carbon sources, but highest levels were found when starch and purified cell walls from Rhizoctonia solani were used. These results are supported by the appearance of one strong band with enzyme activity in non-denaturing PAGE. Experiments using RT-PCR showed that exo-ß-1,3-glucanase induction in T. asperellum occurred at the transcriptional level. We used RT-PCR and real-time PCR analysis to examine the expression of tag83 gene during in vivo assay of T. asperellum against R. solani. We showed that the expression of tag83 is significantly increased by the presence of R. solani