Análise proteômica parcial da peçonha do escorpião colombiano Centruroides margaritatus (Gervais, 1841)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2008.A peçonha de escorpiões é uma mistura complexa de peptídeos que exercem sua atividade modulando canis iônicos de membranas biológicas. O presente projeto teve como objetivo central realizar a análise proteômica da peçonha do escorpião colombiano Centruroides margaritatus. Tal espécie é capaz de produzir acidentes moderados e graves em humanos, no entanto existe pouca informação disponível relacionada aos componentes desta peçonha. A peçonha foi obtida por estimulação elétrica aplicando-se 5 impulsos de 50 V em cada escorpião, liofilizada e armazenada a -20oC. Diferenças significativas na produção de peçonha entre machos e fêmeas e também entre fêmeas grávidas e não-grávidas foram observadas. A peçonha bruta foi submetida a fracionamento por RP-HPLC usando coluna C8 (4.6 x 250 mm) e 43 frações foram eluídas, coletadas e secadas a vácuo. Todas essas frações foram analisadas por MALDI-TOF/MS e detectou-se 91 componentes com massas moleculares distintas. A peçonha de C. margaritatus apresenta 54% de suas toxinas no intervalo de massas moleculares de 2,5 a 6,0 kDa, no qual estão incluídas as toxinas de cadeia curta bloqueadoras de canais para potássio; 13% do total encontram-se no intervalo de 6,5 até 8,0 kDa que corresponde ao grupo das toxinas moduladoras de canais para sódio voltagem-dependentes. Finalmente, 33% dos componentes presentes na peçonha de C. margaritatus são pequenos compostos com 2,0 kDa que fazem parte de um grupo de moléculas raramente descrito nas peçonhas de escorpiões. Também foram isolados e caracterizados quimicamente dois novos peptídeos: a margatoxina 2 (MgTx2), com 24 resíduos de aminoácidos (MM = 2,6 kDa) e três pontes dissulfeto, pertencente à família das das -KTx e a margatoxina 3 (MgTx3) com 30 resíduos de aminoácidos (MM = 3,38 kDa) e três pontes dissulfeto. Trata-se de uma molécula inédita, sem similaridade com outras descritas na literatura. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACTScorpion venoms are a complex mixture of peptides that exert their action via ion-channel modulation in biological membranes. The central objective of this project was to perform the proteomic characterization of the venom from the Colombian scorpion Centruroides margaritatus. This species is capable of producing moderate accidents and serious complications in humans, but little information is available related to its components. The venom was obtained by mild electrical stimulation method, applying 5 impulses of 50 V in each scorpion. It was observed differences in the production of the venom between males and females and also between pregnant and not-pregnant females. The crude venom was fractioned by RP-HPLC using a C8 column (4.6 x 250 mm) and 43 fractions were collected and vacuum dried. All these fractions were analyzed by MALDI-TOF/MS and 91 distinct compounds had their molecular masses characterized. The venom of C. margaritatus exhibits 54% of their toxins in the molecular mass range from 2.5 to 6.0 kDa that probably includes short-chain K+ channel blockers; 13% of the total are in the range from 6.5 to 8.0 kDa and may include long-chain Na+ channel toxins. Finally, 33% of the components present in C. margaritatus venom are peptides smaller than 2.0 KDa, a group rarely described in scorpions venoms. Two novel peptides were purified and chemically characterized: margatoxin 2 (MgTx2), 24 amino acids long (MM = 2,6 kDa) and three disulfide bridges, belonging to the -KTx family and margatoxin 3 (MgTx3), 30 amino acids long (MM = 3,38 kDa) and three disulfide bridges, with no significant similarities to other scorpion neurotoxins described