Produção de hidrolases pelo fungo Dicyma pulvinata, e purificação de uma beta-glucanase do isolado CEN62

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009.A seringueira (Hevea spp.) é uma planta nativa da região amazônica, da qual se extrai o látex para a fabricação da borracha natural. O Brasil já foi o maior produtor mundial de látex, e este já foi responsável por 40% da exportações brasileiras. Esta planta é suscetível ao ataque do fitopatógeno Microcyclus ulei, causador do mal das folhas da seringueira, que é também endêmico da região amazônica e o principal responsável pela queda de produção de látex na América Latina e perda do mercado para países asiáticos como Sri Lanka e Malásia. Entretanto, surgiu dentro deste contexto o fungo micopatogênico Dicyma pulvinata que apresenta alta capacidade de controle do fitopatógeno M. ulei. Considerando esse fato, D. pulvinata pode ser utilizado como uma ferramenta para o controle biológico do mal das folhas da seringueira. Neste trabalho foi analisada a capacidade de produção de glicosil hidrolases (β−1,3-, β−1,3-1-4- e β−1,4-glucanase e quitinase ) por dois isolados CEN62 e CEN93, que haviam demonstrado, em estudos anteriores, serem bons antagonistas do fitopatógeno M. ulei. Assim, foi iniciado um projeto de avaliação da capacidade de produção dessas enzimas por estes dois isolados, e a caracterização de suas propriedades bioquímico-moleculares. Os dois isolados demonstraram capacidades de produção das enzimas β−1,3-, β−1,3-1,4-glucanase e quitinase. No entanto, apenas o isolado CEN62 apresentou atividade de β-glucanase no sobrenadante do meio de cultura. Nenhum dos dois isolados secretou atividade de quitinase. Entretanto, a atividade de quitinase significativa foi encontrada associada ao micélio. Não foi possível, no entanto, a identificação de moléculas relacionadas a essa atividade, quer seja procedendo a lise do micélio na presença de detergente, quer procedendo a lise por sonicação Assim, foi escolhido o sobrenadante do meio de cultura do isolado CEN62 para etapas posteriores de purificação, por apresentar uma atividade de β−1,3-glucanase. O sobrenadante do meio de cultura do isolado CEN62 foi então caracterizado bioquimicamente, observando-se que a atividade de β−1,3-glucanase teve um máximo a 60ºC e pH 5,5, e a atividade de β 1,3-1,4-glucanase o máximo foi de 50ºC e pH 5,5. A β−1,3-glucanase apresentou atividade correspondente a uma meia vida de 10 e 1 minutos a 70ºC e 80ºC respectivamente. O sobrenadante do meio de cultura do isolado CEN62 de D. pulvinata , crescido por dez dias em meio contendo quitina como fonte de carbono, apresentando atividade de β-1,3-glucanase, foi ultrafiltrado com uma membrana de exclusão de 30kDa, concentrado e submetido a uma cromatografia de troca iônica em resina S-Sepharose. Essa cromatografia resultou em um pico de proteínas com atividade de β-1,3-glucanase o qual foi em seguida, recromatografado em uma coluna de troca iônica (DEAE-Sepharose). Um novo pico de proteínas com três espécies protéicas foi obtido, conforme mostrado em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes. O rendimento deste processo de purificação parcial desta β-1,3-glucanase foi de 0,023%, e o fator de purificação de 345,3 vezes. _______________________________________________________________________________ ABSTRACTThe rubber tree (Hevea spp.) is a native plant from the amazonic region, from which the latex is extracted in order to make the natural rubber. Brazil once was the mundial leader in latex production, and it was the responsible for 40% of brazilian exportations. However, this plant is vulnerable to the attacks from the phytopathogen Microcyclus ulei, agent of the leaf blight of the rubber tree, and is also endemic from the amazonic region and the main responsible for the fall in production in latex in latin America, and loss of market shares for the asian countries of Sri Lanka and Malasia. Nonetheless, in this context, the mycopathogen fungus Dicyma pulvinata came forth, and shows high capacities in the biological control of M. ulei. Base don this, there is a new alternative for the biological control for the leaf blight of the rubber tree. In this work the capacity of production of glicosyl hidrolases (β−1,3-, β−1,3-1-4- e β−1,4-glucanase e quitinase) of two isolates CEN62 e CEN93, which had demonstrated in anterior studies to be good antagonists of the phytopatogen M. ulei, were analyzed. Then, a project started to evaluate the capacity of production of these enzymes by these two isolates, and the characterization of their biochemical and molecular properties. The two isolates have demonstrated capacity to product the enzymes β−1,3-, β−1,3-1,4-glucanase and quitinase. Nevertheless, just the isolate CEN62 demonstrated activity of β-glucanase in the medium filtrate. None of the isolates secreted quitinase activity. However, a significant activity of quitinase was found associated to the mycelium. It was not possible, however, to extract this activity nor by cell lysis using detergent, nor by lysing by sonication.Then, the CEN62 medium filtrate was chosen for further purification steps, by showing β−1,3-glucanase activity. The isolate CEN62 medium filtrate was then biochemically characterized, being possible to evaluate that the β−1,3-glucanase activity had a maximum at 60ºC and pH 5,5, and the β 1,3-1,4-glucanase activity had its maximum at 50ºC and pH 5,5. The β−1,3-glucanase activity showed a half-life period of tem and one minutes at 70ºC e 80ºC respectively. The CEN62 medium filtrate of D. pulvinata after growing for tem days in medium containing chitin as carbon source, and containing β-1,3-glucanase activity was ultrafiltrated with an exclusion membrane of 30kDa, and the concentrated was submitted to ion exchange chromatography in S-Sepharose resin. This chromatography resulted in a protein peak with β-1,3-glucanase activity, which was, thereafter, rechromatographed in a ion exchange column (DEAE-Sepharose), resulting in a new protein peak, with three protein species as shown in SDS-PAGE. The yield of this process of β-1,3-glucanase partial purification was of 0,023%, and purification factor of 345,3 times