Mejoramiento cualitativo de espermatozoides ovinos criopreservados a partir de la utilización de moléculas diferenciales de plasma seminal obtenidas por dos métodos de colecta seminal: electroeyaculador y vagina artificial

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Agrarias, área Reproducción, de la Universidad Nacional de Mar del Plata, en marzo de 2018.La aplicación de la inseminación artificial (IA) en cualquier especie requiere del mantenimiento del semen en condiciones no fisiológicas. En ovinos, la IA con semen refrigerado se encuentra más difundida que con semen congelado debido a los bajos porcentajes de preñez obtenidos con este último. Estos resultados se deben a la complejidad del cérvix de la oveja, que dificulta el paso del instrumental de IA y deposición del semen en la luz uterina, y a la mayor sensibilidad espermática a la criopreservación. Una de las razones de la baja fertilidad obtenida con semen congelado sería la criocapacitación, debida a una redistribución lipo-protéica de la membrana plasmática durante la congelación. En estudios previos del grupo se observó que la calidad espermática se ve afectada por el método de colecta, por lo que se hipotetizó que podría relacionarse al contenido de plasma seminal (PS) de los eyaculados y que esto, a su vez, influiría en la sensibilidad espermática a la criopreservación. Se compararon eyaculados obtenidos con vagina artificial (VA) y electroeyaculador (EE) en estado fresco y luego de la criopreservación y los componentes proteicos del PS. Se observó que, los eyaculados frescos obtenidos con EE presentaron mayor calidad, proporción de PS y contenido de proteínas totales. Ha sido demostrado que las proteínas del PS previenen/revierten algunos de los daños ocasionados por la congelación y mantienen a los espermatozoides en un estado no capacitado. Este efecto se debería a una fracción del PS compuesta por proteínas que interactúan con la superficie espermática (PPSiE), pertenecientes a una familia de proteínas compuestas por un doble dominio de fibronectina tipo II (FN-II). Luego de analizar el efecto del agregado de las PPSiE a espermatozoides criopreservados se observó que su adición revirtió la criocapacitación, sin diferencias entre métodos y estaciones de colecta. Con el objetivo de establecer si las subpoblaciones espermáticas influyen en el efecto de determinados tratamientos se llevó adelante su caracterización en semen criopreservado en base a sus características de movilidad y se comparó la distribución en carneros de alta y baja fertilidad. Fueron distinguidas cuatro subpoblaciones en el semen descongelado distribuidas diferencialmente según la fertilidad del reproductor. Al evaluar el efecto de las PPSiE se observó interacción entre el tratamiento y la estación de colecta y diferencias según el método de colecta, opuestamente a lo observado al analizar a la población en conjunto sin distinguir entre poblaciones. Destacando los inconvenientes que ocasiona ignorar la variabilidad de las muestras seminales. Los resultados obtenidos demostraron que las proteínas del PS son capaces de revertir los daños ocasionados por la criopreservación, pero debido a que su concentración como la capacidad para proteger a los espermatozoides es muy variable, se planteó la expresión de un péptido recombinante compuesto por cuatro dominios de FN-II, que podría llevar adelante la actividad crioprotectora. Se logró expresar en E. coli una proteína compuesta por tiorredoxina, cuatro dominios de FN-II y un tag de histidina y se observó que esta se unió preferentemente a la región acrosomal y pieza media de los espermatozoides, siendo capaz de revertir la fosforilación en sustratos de PKA y al ser utilizada en la concentración 0,3 μM aumentó el porcentaje de fecundación in vitro. Los resultados obtenidos podrían servir para el desarrollo de estrategias biotecnológicas para mejorar la calidad y la capacidad fecundante del semen ovino criopreservado.The application of artificial insemination (AI) in any species requires the maintenance of semen under non-physiological conditions. In sheep, AI with refrigerated semen is more widespread than with frozen semen due to the low percentages of pregnancy obtained. These results are due to the complexity of the sheep's cervix, which makes it difficult to pass the AI instruments and deposition of the semen in the uterine lumen and to the greater sperm sensitivity to cryopreservation. One of the reasons for the low fertility obtained with frozen semen would be cryocapacitation, due to a lipoprotein redistribution of the plasma membrane during freezing. In previous studies of the group it was observed that the sperm quality is affected by the collection method, so it was hypothesized that it could be related to the seminal plasma (SP) content of the ejaculates and that this, in turn, would influence the sperm sensitivity to cryopreservation. Ejaculates obtained with artificial vagina (AV) and electroejaculation (EE) were compared in fresh and after cryopreservation and the SP protein components. It was observed that, fresh ejaculates obtained with EE presented higher quality, proportion of SP and total protein content. It has been shown that SP proteins prevent/reverse some of the damage caused by freezing and keep the sperm in anon-capacitated state. This effect is due to a fraction of the SP composed of proteins that interact with the sperm surface (PPSiE), belonging to a family of proteins composed of a double domain of fibronectin type II (FN-II). After analyzing the effect of adding the PPSiE to cryopreserved spermatozoa, it was observed that their addition reversed the cryocapacitation, without differences between methods and collection seasons. In order to establish how sperm subpopulations could influence the effect of certain treatments, their characterization in cryopreserved semen was carried out based on their motility characteristics, and the distribution in rams of high and low fertility. Four subpopulations in the thawed semen were differentially distributed according to the reproductive fertility. When evaluating the effect of the PPSiE, interaction between the treatment and the collection season was observed and differences according to the collection method, opposite to what was observed when analyzing the population as a whole without distinguishing between populations. Highlighting the inconvenience caused by ignoring the variability of the seminal samples. The results obtained showed that SP proteins are capable of reversing the damage caused by cryopreservation, but because their concentration as the ability to protect sperm is very variable, the expression of a recombinant peptide composed of four domains of FN-II was proposed which could carry out the cryoprotective activity. It was possible to express a protein composed of thioredoxin, four domains of FN-II and a histidine tag. It was observed that this was preferentially bounded to the acrosomal region and middle piece of the sperm, being able to reverse the phosphorylation in PKA substrates and when used in the concentration 0.3 μM increased the percentage of in vitro fertilization. The results obtained could be used to develop biotechnological strategies to improve the quality and fertility of cryopreserved sheep semen.EEA BalcarceFil: Ledesma, Alba Verónica. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentin