Identificación y caracterización molecular de mutaciones en pacientes con enfermedad de Pompe. Análisis del transcriptoma de sangre periférica

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 28-02-2020Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 28-08-2021La Glucogenosis tipo II, también conocida como enfermedad de Pompe, es una enfermedad genética con un patrón de herencia autosómico recesivo, producida por el déficit de la enzima alfa glucosidasa acida lisosomal, responsable de la ruptura del glucógeno en esa organela subcelular. Es una patología con una gran variabilidad clínica, que depende principalmente del grado de actividad enzimática residual, lo que dificulta de manera apreciable el diagnóstico y condiciona su evolución. En este trabajo hemos estudiado una cohorte de 259 pacientes con sospecha de padecer la enfermedad. Para ello, hemos puesto a punto un abordaje mediante secuenciación Sanger de las regiones exónicas e intrónicas flanqueantes del gen GAA. Para identificar algunos tipos de reordenamientos complejos hemos enriquecido el estudio con un MLPA de diseño propio. Esta aproximación nos ha permitido alcanzar un diagnóstico genético confirmatorio en 76 pacientes, detectando 20 variantes nuevas, no descritas anteriormente, de las que 2 son deleciones detectadas gracias al MLPA, una de ellas afecta a la estructura completa del gen GAA y parte del gen contiguo CCDC40, siendo la mayor descrita hasta el momento. Además, la mutación c.-32-13T>G ha sido identificada en el 84,3% de los pacientes con la forma tardía de la enfermedad. Hemos realizado la caracterización funcional de 16 variantes, para explorar su potencial implicación en el procesamiento del mRNA. El método utilizado pone de manifiesto tanto alteraciones cualitativas como cuantitativas que afectan al rendimiento y la calidad del mRNA resultante de un alelo mutado. Esto nos ha permitido dilucidar el papel de 7 de estas variantes en un procesamiento aberrante del RNA mensajero. Entre ellas, hemos detectado la implicación en el procesamiento de la variante missense c.1704C>G (p.H568Q), de la nonsense c.343C>T (p.Q115*), de la variante sinónima c.546G>C (p.T182T), así como de las variantes que afectan a sitios canónicos de splicing c.1075+1G>A, c.1637-2delA y c.1889-1G>A. También hemos podido establecer la implicación de la variante c.1194+5G>A en el procesamiento aberrante del mRNA y, de ese modo, determinar su patogenicidad. Antes de este trabajo esta variante era considerada como no patogénica. El análisis de transcriptoma en células de sangre periférica ha permitido determinar la desregulación de rutas relacionadas con la respuesta inmune, como la vía de señalización de TNFa a través de NFKB, así como la apoptosis, entre otras. Asimismo, se ha detectado una desregulación del sistema ubiquitina-proteasoma, implicado principalmente en la degradación de proteínas intracelulares. Las diferencias de expresión observadas con grupos seleccionados de genes han permitido una agrupación no supervisada, capaz de discriminar entre pacientes y controles. Esta puede ser la base para obtener una firma génica y ayudar en la búsqueda de nuevos biomarcadoresType II glycogenosis, also known as Pompe disease, is an autosomal recessive disorder. It is produced by the deficit of the lysosomal enzyme acid-alpha-glycosidase, responsible for the breakdown of glycogen in that subcellular organelle. It is a pathology with great clinical variability, which mainly depends on the degree of residual enzymatic activity. It makes diagnosis difficult and determines the evolution. In this work we have studied a cohort of 259 patients with suspected disease. To this end, we have set up an approach through Sanger sequencing of the exonic and flanking intronic regions the GAA gene. To assess some types of complex rearrangements we have enriched the study using a homemade MLPA. This approach allowed us to reach a confirmatory genetic diagnosis in 76 patients. In addition, we have discovered 20 new variants, two of which are deletions detected by the new MLPA. One of these deletions spans the complete structure of GAA gene and part of the adjacent CCDC40, being the largest described so far. In addition, the c.-32-13T>G mutation has been identified in 84.3% of patients with the late form of the disease. We have performed the functional characterization of 16 variants, to explore its potential involvement in mRNA processing. The procedure reveals both qualitative and quantitative alterations affecting the performance and quality of mRNA resulting from a mutated allele. This has allowed us to elucidate the role of 7 of these variants in aberrant messenger RNA processing. In particular, we have detected the implication in RNA processing of the missense c.1704C>G (p.H568Q), the nonsense variant c.343C>T (p.Q115*), the synonymous variant c.546G>C (p.T182T). At the same time, several variants that affect canonical splicing sites such as c.1075+1G>A, c.1637-2delA and c.1889-1G>A, were analyzed with the methodology. We have also been able to establish the involvement of the c.1194+5G>A variant in the aberrant processing of mRNA and thereby determine its pathogenicity. Prior to this work this variant was considered non-pathogenic. The transcriptome analysis in peripheral blood cells has allowed to determine the deregulation of routes related to the immune response, such as the TNFa signaling pathway through NFKB, as well as apoptosis, among others. Likewise, a deregulation of the ubiquitin-proteasome system has been detected, mainly involved in the degradation of intracellular proteins. The differences in expression observed with selected groups of genes have allowed an unsupervised clustering, capable of discriminating between patients and controls. This may be the basis for obtaining a gene signature and assisting in the search for new biomarker