Biofunctional silk-fibroin membranes with antioxidant properties for the treatment of chronic wounds

Atualmente, as feridas crónicas são uma patologia cada vez mais recorrente, apresentando uma maior incidência na população idosa, principalmente quando existem fatores de co-morbilidade, tais como Diabetes Mellitus e doenças cardiovasculares. Nos últimos anos, têm sido propostos novos materiais de penso, incorporando uma diversidade de agentes bioativos para o tratamento de feridas crónicas. Entre os biomateriais naturais propostos, a seda ganhou atenção devido à sua biocompatibilidade, biodegradação, por ser facilmente modificada quimicamente e por possuir boas propriedades mecânicas. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento, otimização, e caracterização de membranas biofuncionais feitas à base de fibroína de seda (SF), com a incorporação de dois agentes antioxidantes (ácido cafeico – CA – e ácido tânico – TA) para o tratamento de feridas crónicas superficiais e consequente regeneração da pele. Através da técnica de solvent casting, seguida de um tratamento térmico, produziram-se membranas estáveis, que foram posteriormente caracterizadas relativamente à morfologia da superfície (SEM e perfilometria ótica), à composição química (FTIR-ATR), perfil de degradação, performance mecânica, análise térmica (TG-DTA), capacidade antioxidante e citocompatibilidade. A degradação foi avaliada pela percentagem de peso perdido pelas amostras. A atividade antioxidante foi avaliada pelo método ABTS. Os testes de citocompatibilidade foram realizados, utilizando a linha celular imortalizada de células de fibroblastos de rato (L929), através do método de contacto direto e dos extratos. Todas as membranas desenvolvidas demonstraram ser transparentes, inodoras, apresentando uma superfície homogénea, ainda que com espessura variável. As imagens de SEM mostraram que todas as membranas apresentavam uma superfície lisa e homogénea, sem rugosidade aparente à escala micrométrica. Através da perfilometria ótica concluiu-se que, à escala nanométrica, a adição de glicerol aumentou a rugosidade da superfície e, através dos ensaios mecânicos, verificou-se que este composto reduziu a rigidez das membranas, tornando-as mais maleáveis. Com as membranas no estado seco, os agentes antioxidantes potencializaram um efeito anti-plasticizante, enquanto, no estado hidratado, a água potencializou o efeito plasticizante do glicerol. As membranas de SF apresentaram uma massa constante ao longo de 15 dias, em PBS, enquanto que as restantes membranas apresentaram uma perda de massa inicial de aproximadamente 30%, após as primeiras 2 horas de incubação, maioritariamente relacionada com libertação de glicerol. Com a presença de Protease XIV, a mesma perda de massa inicial foi observada, aumentando drasticamente após 24 horas de incubação, evidenciando a suscetibilidade da seda para a degradação proteolítica. A resistência térmica da SF diminuiu com a introdução do glicerol nas formulações. À concentração de 0.5% de ambos os agentes antioxidantes essa propriedade foi aumentada e o oposto foi observado na concentração de 1%. As membranas de SF mostraram ter capacidade antioxidante, tendo a adição de 0.5% TA reforçado este efeito. Apenas o extrato puro de 1% TA revelou um efeito citotóxico para as células L929. Todas as restantes membranas não apresentaram citotoxicidade. Este sistema demonstrou ser bastante promissor, reconhecendo a capacidade das membranas de SF para incorporar moléculas antioxidantes e o seu possível potencial no tratamento de feridas crónicas.Nowadays, chronic wounds are an increasingly recurrent pathology, presenting a higher incidence in the elderly population, especially when there are comorbidity factors such as Diabetes Mellitus and cardiovascular diseases. In recent years, new dressing materials incorporating a variety of bioactive agents have been proposed for the treatment of chronic wounds. Among the proposed natural biomaterials, silk gained attention due to its biocompatibility, biodegradation, for being easily chemically modified and due to its good mechanical properties. The objective of this study was the development, optimization, and characterization of biofunctional silk fibroin (SF) based membranes, with the incorporation of two antioxidants agents (AA) (caffeic acid - CA - and tannic acid - TA) for the treatment of superficial chronic wounds and consequent regeneration of the skin. Stable membranes were produced using the technique of solvent casting followed by a thermal treatment, which were characterized regarding surface morphology (SEM and optical profilometry), chemical structure (FTIR-ATR), degradation profile, mechanical performance, TG-DTA, antioxidant capacity and cytocompatibility. The degradation was assessed by obtaining the percentage of weight lost by samples. Antioxidant activity was evaluated by the ABTS method. Cytocompatibility tests were performed using the immortalized cell line of mouse fibroblast cells (L929) by direct contact and extracts tests. All the membranes were transparent, odorless and presented a homogeneous surface, although with variable thickness. SEM images showed that all membranes had a smooth and homogeneous surface, with no apparent roughness at the micrometer scale. Optical profilometry showed that, at the nanoscale, the introduction of glycerol (Gly) in the formulations increased the surface roughness and, the mechanical tests confirmed that this compound reduced the stiffness of the membranes, making them more malleable. With the membranes in the dry state, the AA potentiate an anti-plasticizer effect, while, in the hydrated state, water has potentiated the plasticizer effect of Gly. SF membranes exhibited a constant mass over 15 days in PBS, while the remaining membranes showed an initial weight loss of approximately 30%, after the first 2 hours of incubation, most likely related to Gly release. In the presence of Protease XIV, the same initial weight loss was observed, increasing drastically after 24 hours of incubation, evidencing the susceptibility of the silk to the proteolytic degradation. The thermal resistance of SF decreased with the introduction of Gly. At a concentration of 0.5%, the AA increased this property and the opposite was observed when the concentration raised to 1%. SF membranes showed to have antioxidant capacity, and the addition of 0.5% TA reinforced this effect. The pure 1% TA extract revealed a cytotoxic effect in L929 cells. All other membranes were non-cytotoxic. This system proved to be quite promising, recognizing the ability of SF membranes to incorporate antioxidant molecules and their potential in the treatment of chronic wounds