HİPOKSİK MCF 7 MEME KANSERİ HÜCRE KÜLTÜRÜNDE GLUKOZ KATABOLİZMASININ ARAŞTIRILMASIHİPOKSİK MCF 7 MEME KANSERİ HÜCRE KÜLTÜRÜNDE GLUKOZ KATABOLİZMASININ ARAŞTIRILMASI

Bu çalışmada hipoksinin MCF-7 kanser hücrelerinin glukoz katabolizması üzerine olan etkilerinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Normoksi ve hipoksi ortamlarına yerleştirilen kanser hücreleri belirli inkübasyon süreleri (3, 6, 12, 24 ve 48 saat) boyunca farklı konsantrasyonlarda (0, 5.5, 15 ve 55 mM) glukoza maruz bırakılmıştır. Oksijen gerilimi ve glukoz miktarının hücrelerin canlılığı üzerine etkisini belirleyebilmek adına tüm uygulama gruplarında WST-1 canlılık analizi gerçekleştirilmiştir. Normoksik ortamda konsantrasyona bağlı olarak 12. saatten sonra canlılık oranlarının arttığı tespit edilmiştir. Hipoksik ortamda hem zamana hem de konsantrasyona bağlı bir şekilde canlılık oranlarının kademeli olarak artış gösterdiği belirlenmiştir. Hücre lizatlarındaki glikolitik metabolizmayı yansıtan kilit enzimlerin (hekzokinaz-2 ,fosfofruktokinaz P, piruvat kinaz M2, laktat dehidrogenaz A, glukoz-6-fosfat dehidrogenaz) ELISA yöntemi ile miktar tayini gerçekleştirilmiştir. Ekstrasellüler laktat düzeyleri ve glukoz miktarları kolorimetrik yöntemle tayin edilmiştir. Glukoz ve oksijen düzeylerinin hücrelerin göç etme potansiyelleri üzerine etkisini görebilmek adına ise yara iyileşmesi testi yapılmıştır. Yüksek konsantrasyonda glukoz içeren grupların hipokside normoksiye kıyasla glukoz tüketiminin daha fazla olduğu (12. saat hariç) (p<0,001) ve bu sonucun hücre canlılığı sonuçları ile paralellik gösterdiği tespit edilmiştir. Hem normoksik hem de hipoksik ortamdaki hiperglisemik (55 mM glukoz) hücrelerde 6. saatten itibaren hücre migrasyonu hızlanmış, yara açıklığı yüzdeleri azalmıştır. Ayrıca glukozsuz ortamda hücrelerin morfolojik görüntüleri değişime uğramıştır. Hipoksik hücrelerde glukoz içermeyen uygulama gruplarına kıyasla artan glukoz konsantrasyonuna bağlı ekstrasellüler laktat seviyelerinin yükselmesi (p<0,05), Crabtree etkisinin baskın çalıştığını kanıtlar niteliktedir. Ortamda artan ürün miktarının enzim sentezini durdurmasına bağlı hipoksik ortamda LDHA düzeylerinin zamana bağlı anlamlı bir şekilde azaldığı tespit edilmiştir (p<0,001). Hipoksi koşullarında tüm konsantrasyonlar için (PKM2 için glukozsuz ortam haricinde) 6. saatteki PKM2 ve G6PD enzim miktarları en yüksek düzeyde tespit edilmiş (p<0,001) ve kısa süreli hipoksi maruziyetinin hem glikolitik yolağı hem de pentoz fosfat yolu (PPP)'nu çalıştırarak enzim sentezini başlattığı öngörülmüştür. G6PD enzim seviyelerinin normokside hipoksiye göre tüm gruplar için (12. saat hariç) daha yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0,001). Bu veriler, normal oksijen koşulları altında glukozun PPP’na yönlendirildiğini göstermektedir. Uzun süreli hipoksi maruziyetinin hiperglisemik ortamda glikolitik akışı tetiklediği bilgisini doğrular nitelikte 15 ve 55 mM glukoz içeren hipoksi uygulama gruplarında 48 saatlik inkübasyon sonucunda PKM2 enzim miktarlarının artış gösterdiği sonucuna ulaşılmıştır. Glikolizin iki kilit enzimi HK2 ve PFKP’nin normoksik ortamda birbiriyle denge halinde azalan ve artan grafikler sergilediği görülmüştür. PFKP enzimi için hiperglisemik ortamda normoksi ve hipoksi arasındaki farklılıklar daha belirgin olmakla beraber 15 mM glukoz ortamında 6. ve 24. saatlerde hipokside normoksiye göre sırasıyla 14,91 ve 56,5 kat artış gözlenmiştir (p