Analysis of the breathing apparatus of the cerambycid species that colonizes pines infected by the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer, 1934) Nickle, 1970, with special emphasis to the insect-vector Monochamus galloprovincialis (Olivier, 1795).

Tese de mestrado, Ecologia e Gestão Ambiental, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020A Doença da Murchidão do Pinheiro foi primeiramente detetada em Portugal em 1999 na Marateca, Península de Setúbal. O agente causador desta doença, que leva à morte da árvore infetada, é Bursaphelenchus xylophilus, um nematode micofágico, oriundo da América do Norte, que coloniza várias espécies de coníferas, especificamente Pinus spp, usando como vetor um inseto do Género Monochamus (Coleoptera). Enquanto que as espécies nativas da América apresentam resistência, ou alguma tolerância à infeção por parte do nematode, as espécies Asiáticas e Europeias são suscetíveis, desenvolvendo uma sintomatologia característica, que leva ao rápido apodrecimento e morte da árvore. Este facto suporta a teoria de que o Nematode da Madeira do Pinheiro (como ficou conhecido) terá sido transportado desde a América até ao Japão, onde a doença foi inicialmente detetada no início do século XX, em madeira infetada e não tratada. Após a entrada no Japão, o nematode espalhou-se rapidamente pela China, Tailândia e Coreia. A doença é o resultado de uma complexa interação entre o nematode, o inseto-vetor, a conífera hospedeira e vários fatores climáticos, o que atrasou a atribuição de uma relação causa-efeito entre a presença do nematode e os sintomas da doença, permitindo a larga propagação da mesma. Em Portugal, e na Europa, tem afetado essencialmente espécies como Pinus nigra, P. sylvestris e P. pinaster, representado perdas significativas de rendimentos e de biodiversidade. Devido ao seu grande potencial destrutivo, o Nematode de Madeira do Pinheiro (NMP) está listado na Diretiva Europeia 2000/29/CE para medidas de proteção contra a introdução e propagação de organismos prejudiciais o que levou a restrições na comercialização de madeiras e de subprodutos não tratados tal como de plantas vivas. O nematode, que mede apenas 1.5 milímetros, tem uma alta taxa de reprodução e um ciclo de vida de duas fases, uma em que se alimenta de fungos e outra em que se alimenta de células vivas do parênquima. Também se desenvolve de duas formas distintas; se as condições forem favoráveis desenvolve-se rapidamente sob a forma “Reprodutora”, se as condições começarem a ser desfavoráveis, ou seja, quando a árvore hospedeira decai, desenvolve-se como uma forma de “Dispersão” que é uma forma mais resistente. É nesta fase que o nematode migra para junto das câmaras pupais do inseto vetor e aguarda pela muda das pupas para infestar os adultos recém-formados. O inseto vetor do Género Monochamus com distribuição em Portugal é M. galloprovincialis (Olivier,1795), um besouro endémico Cerambicídeo, da subfamília Lamiinae, considerado uma praga secundária pelo que não existia muita informação sobre a sua ecologia e anatomia antes da entrada do nematode no país. Tem um ciclo de vida univoltino ou seja, produz descendência apenas uma vez no ano, para se reproduzir tem de se alimentar de rebentos da copa de pinheiros saudáveis, a chamada alimentação de maturação sexual. Os machos produzem feromonas para atrair as fêmeas para a reprodução e as fêmeas para ovipositar necessitam de pinheiros em declínio ou mortos recentemente. As larvas e pupas do inseto vetor, e outros colonizadores dos pinheiros, convivem com juvenis do nematode dentro da madeira do pinheiro durante os vários meses de desenvolvimento do inseto. De alguma forma, o nematode identifica as pupas do inseto vetor e aguarda pela última muda para entrar no sistema respiratório através dos espiráculos dos adultos recém-formados. O inseto depois emerge da árvore hospedeira, transportando o nematode e transmitindo-o para novas árvores durante a sua alimentação, ocorrendo a “Transmissão Primária”. As fêmeas infetadas, quando depositam os seus ovos em árvores enfraquecidas também podem transmitir o nematode, ocorrendo a chamada “Transmissão Secundária”. Inserido no Projeto NEMATRANSFER (PTDC/AGR-FOR/4391/2014), esta dissertação visa a análise do Sistema Respiratório, espiráculos e traqueia, do inseto vetor e de 3 outras espécies colonizadoras do pinheiro bravo, nomeadamente Arhopalus syriacus (Reitter, 1895), Acanthocinus griseus (Fabricius, 1793), e Pogonocherus perroudi Mulsant, 1839 que são as mais abundantes e mais próximas filogeneticamente da espécie vetora, na tentativa de isolar características que possam ser barreiras físicas à entrada do nematode nas espécies não vetores, na expectativa que os dados obtidos possam ser usados na criação de novas medidas de gestão de pragas. Para alcançar o objetivo principal, foram testados protocolos de preparação de exemplares para se conseguir uma caracterização dos espiráculos (tamanho e existência, ou não, de sedas) através de imagens obtidas em Microscopia Eletrónica de Varrimento (MEV) e medições da traqueia e suas ramificações usando Micro Tomografia de raio X (Micro-CT) e modelos 3D dos exemplares. A Micro-CT é uma técnica não invasiva, baseada na interação dos raios X com os diferentes constituintes da amostra, que permite a observação da anatomia interna dos exemplares uma vez que produz imagens de alta resolução que podem depois ser integradas para gerar um volume virtual da mesma. Esta técnica permite também individualizar partes dos exemplares, por exemplo certos órgãos, usando o software CTAnalyzer (distribuído por BRUKER®), também conhecido como “Segmentação”. A MEV é amplamente usada para observar estruturas ao nível da superfície das amostras. Um feixe de eletrões, chamados eletrões primários, passa rapidamente pela superfície da amostra. Antes da observação em MEV, a mostra é metalizada com ouro, ou ouro-paládio, para promover a emissão de eletrões, chamados eletrões secundários, o impulso elétrico é depois detetado e transformado numa imagem. Para a preparação e estabilização dos exemplares para suportarem estas técnicas, tentou-se a Fixação Química com glutaraldeído e tetróxido de ósmio seguida de Secagem pelo método do Ponto Crítico e como alternativa a este processo moroso, a Liofilização que consiste numa sublimação a baixa pressão e temperatura. Obtivemos sucesso em ambos os procedimentos, com percentagens semelhantes entres estes, no entanto não foi possível preparar o mesmo número de indivíduos com ambas as técnicas, pois as larvas recolhidas não eram igualmente distribuídas pelas quatro espécies em análise e algumas larvas morreram antes da muda. Os exemplares estabilizados foram observados no microscópio eletrónico para avaliar a sua integridade e foram distribuídos entre as técnicas de observação, MEV ou Micro-CT. Devido ao moroso processo de estabilização e ao tempo gasto na resolução dos problemas metodológicos e na agilização do processo de tratamento dos exemplares, não foi possível atingir as repetições inicialmente planeadas e necessárias para uma avaliação estatística adequada sobre o sucesso entre os diferentes métodos de preparação. As fotografias dos espiráculos, obtidas na MEV, foram analisadas com o software ImageJ e as medições obtidas foram trabalhadas em Excel. Foi medida a área total de 199 espiráculos de 1 pupa e 9 adultos M. galloprovincialis, 2 pupas e 10 adultos A. Syriacus, 3 A. griseus adultos e 1 P. perroudi. tal como a área do espiráculo não coberta por sedas e a circularidade, uma razão entre a área e o perímetro, automaticamente calculada pelo ImageJ, que permite classificar a forma do espiráculo como mais circular, se o valor se aproximar de 1, ou mais elíptica se o valor se aproximar de 0. Os resultados obtidos através das medições feitas, indicam que os espiráculos dos adultos de M. galloprovincialis são os que apresentam a menor percentagem de área descoberta, ou seja, a área em que não há sedas a cobrir a entrada do espiráculo, quando comparados com os adultos das outras três espécies estudadas, que não desempenham um papel de disseminação do nematode. Enquanto que os espiráculos dos adultos das espécies A. syriacus e A. griseus estão mais desprotegidos, tendo uma menor percentagem de cobertura de sedas, os espiráculos de M. galloprovincialis têm mais sedas que poderão ser facilitadoras do movimento do nematode para dentro do espiráculo enquanto também preservam um nível de humidade favorável à sobrevivência, e à própria movimentação, do NMP. Por outo lado, as pupas de M. galloprovincialis apresentam uma cobertura de sedas ainda maior que o adulto da mesma espécie, o que nesta fase de desenvolvimento do inseto pode atuar como uma barreira física à entrada do nematode e que poderá explicar por que razão este só infecta o inseto adulto. Apesar de várias dificuldades em agilizar o processo de segmentação que acabou por inviabilizar a individualização da rede de ramificações da traqueia, através das radiografias obtidas da Micro-CT foi possível identificar quatro principais ramificações na cabeça e tórax e duas ramificações no abdómen de insetos das espécies M. galloprovincialis, A. syriacus e A. griseus, que são consistentes com as descrições morfológicas consultadas. Também foi possível medir o diâmetro das ramificações, nesses mesmos indivíduos, e posteriormente fez-se uma estimativa do volume das traqueias observadas. Os resultados obtidos das medições, indicam que o volume total da traqueia é maior em insetos maiores, o que corrobora o fato de as traqueias se estenderem por todo o corpo para que o oxigénio chegue a todos os órgãos e tecidos. Ao comparar o macho e a fêmea de M. galloprovincialis é notável a diferença de volume da traqueia ao nível do abdómen, sendo o da fêmea praticamente o dobro do macho, mas o volume total de ambos é semelhante o que sugere que poderá haver uma distribuição desigual das ramificações da traqueia consoante o sexo, para esta espécie, o que não se verifica no macho e fêmea de A. griseus que foram também medidos. Todos estes pontos resultantes do trabalho feito e da comparação entre a espécie vetor do NMP e as outras espécies estudadas, que convivendo com o nematode nas árvores hospedeiras não desempenham um papel de disseminadoras, poderão trazer novas perspetivas sobre a complexa interação entre o inseto vetor e o NMP. Todo o trabalho feito na preparação dos indivíduos é também uma mais valia para futuros trabalhos que tenham como objetivos a observação de estruturas anatómicas semelhantes. Todos os dados obtidos são originais e podem ser relevantes para futuras propostas de gestão do NMPThe Pine Wilt Disease (PWD) is caused by a non-indigenous nematode, Bursaphelenchus xylophulis, that disseminates widely through a flying insect-vector, Monochamus galloprovincialis (Oliver, 1795), colonizer of the pine tree, leading the trees to death due to the clogging of the tree vessels. It remains unknown how the nematode identifies and infect the newly formed adult individuals of the vector species. Whereby, in the procedure of the project NEMATRANSFER (PTDC/AGR-FOR/4391/2014), we compare anatomic structures of pupae and adult insects of the vector species and other three cerambycid species, Arhopalus syriacus (Reitter, 1895), Acanthocinus griseus (Fabricius, 1793), and Pogonocherus perroudi Mulsant, 1839, in as attempt to recognize differences that may be considered as physiological barriers to nematode entry in non-vector species. To accomplish the main goal, several protocols were tried to achieve a characterization of the spiracles (measures, existence, or not, of bristles) using Scanning Electron Microscopy images and to measure the tracheal system (its length, ramifications, etc.) with Micro-computed Tomography and 3D models using proper software. From the obtained SEM results we presume that, while the non-vector species spiracles’, have lower bristles coverage, the insect-vector has only a small area not covered by them. This can imply that the bristles should help the nematode to tangle itself and crawl into the trachea while provide a moisture environment that also favour the nematode survival and movement. On the other hand, the bristles coverage of the pupae may be so dense that in this stage of the insect development it can work like an obstacle for the nematode entrance. This may be the reason why the PWN enter the spiracles only when the newly adult insects are formed. It has found evidence that the shape of the spiracles may represent an important feature to explain how PWN colonizes the insect-vector, or why it prefers M. galloprovincialis over the other species. In what concerns the Micro-CT results, we were able to identify four main tracheal trunks in the head and thorax and two main trunks in the abdomen of M. galloprovincialis, A. syriacus and A. griseus specimens. Also it was possible to measure tracheal trunks in one lyophilized specimen, in specimens fixated with glutaraldehyde and osmium tetroxide, and critical point dried, and even in not treated specimens, although in this last case it was harder to find the main trachea trunks lengthwise the entire body of the insect. The volume estimated values obtained are consistent with the insects’ body length, being higher in bigger specimens, and diameter and number of the main trunks are consistent with the described morphology of the trachea ramifications for Coleoptera insects. By comparing the abdominal tracheal volumes of both M. galloprovincialis male and female specimens, it seems that a differential ramification arrange occurs, as the female abdominal tracheal volume is twice of the male while the total volume is similar. All the worked done for the stabilization and preparation of the samples to endure SEM and Micro-CT is an asset for future similar studies. Our results, obtained by comparing the vector species with the non-vector species, that also share the host tree but do not have a role in the spread of the nematode may bring some understanding about the complex interaction between the PWN and the insect- vector. All our data are original and may be relevant for future pest managements measures