Einfluss von Anti-Thymozyten-Globulin und Defibrotid auf die Proliferation, Migration und angiogene Aktivität von Endothelzellen

EINLEITUNG: Die allogene hämatopoietische Stammzelltransplantation (hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT) ist eine Standardtherapie zur Behandlung von akuten Leukämien und anderen hämatologischen Neoplasien. Wesentliche Komplikationen der allo-HSCT sind Graft-versus-Host-Disease (GVHD) und Veno-occlusive Disease/Sinusoidal Obstruction Syndrome (VOD/SOS). Bei diesen beiden Erkrankungen kommt es initial zu einer multifaktoriellen Schädigung der Endothelzellen mit einer nachfolgenden endothelialen Entzündungsreaktion, die letztendlich zu Organschädigungen führen kann. Der polyklonale Antikörper Anti-Thymozyten-Globulin-Fresenius (ATG-F) wird zur Prophylaxe der GVHD eingesetzt und das endothelprotektive Medikament Defibrotid (DF) wird zur Prophylaxe der VOD/SOS eingesetzt. Die Wirkung dieser beiden Standardmedikamente der allo-HSCT auf Endothelzellen ist bisher noch nicht ausreichend experimentell untersucht worden. In dieser Arbeit soll die Hypothese getestet werden, dass ATG-F endotheliale Funktionen hemmen und somit die Neovaskularisierung beeinträchtigen kann. Als zweite Hypothese soll getestet werden, dass DF endotheliale Funktionen fördern und dadurch die endotheliale Regeneration unterstützen kann. METHODIK: Mithilfe von drei in vitro Assays habe ich den Effekt von ATG-F und DF auf Funktionen von humanen Endothelzellen, die aus der Nabelschnurvene isoliert werden (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVECS), beobachtet: 1) den Scratch Assay, der die Proliferation und Migration misst; 2) den MTT Assay, der die Proliferationsrate misst; und 3) den Tube Formation Assay, der die angiogene Aktivität misst. ERGEBNISSE: ATG-F hemmt die Migration und Proliferation von Endothelzellen im Scratch Assay signifikant und bewirkt eine signifikante dosisabhängige Inhibierung der Zellproliferationsrate im MTT Assay. ATG-F hat jedoch keinen signifikanten Effekt auf die angiogene Aktivität der HUVECS im Tube Formation Assay. DF hemmt signifikant die Zellproliferationsrate im MTT Assay und die angiogene Aktivität der HUVECS im Tube Formation Assay in dosisabhängiger Form. DF hat jedoch keinen signifikanten Effekt auf die Zellmigration und -proliferation im Scratch Assay. SCHLUSSFOLGERUNG: Zusammengefasst konnten in dieser Arbeit bisher unbekannte Wirkungen von ATG-F und DF, zwei in der Transplantationsmedizin häufig verwendete Medikamente, auf die Endothelfunktion nachgewiesen werden. Beide getesteten Medikamente hemmen die Funktion von Endothelzellen in dosisabhängiger Beziehung. Dies hat potentiell wichtige klinische Implikationen. In der frühen Phase nach einer allo-HSCT könnte sowohl durch ATG-F als auch durch DF ein positiver Effekt vermittelt werden. Die GVHD-assoziierte pathologische Neovaskularisierung könnte gehemmt werden, was zur Reduktion des Schweregrads der akuten GVHD führen würde. In der späten Phase nach einer allo-HSCT sind hingegen eher negative Effekte durch die Hemmung der Endothelfunktion zu erwarten. Die Reparatur von Endothelschäden und die physiologische Endothelregeneration könnte gehemmt werden und potentiell zur Verstärkung von Endothel-assoziierten Komplikationen nach allo-HSCT, wie beispielsweise Mikroangiopathie, chronische GVHD und VOD/SOS, führen.INTRODUCTION: The allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is a standard form of therapy used in acute leukaemia and other hematological neoplasia. Important complications are graft-versus-host-disease (GVHD) and veno-occlusive disease/sinusoidal obstruction syndrome (VOD/SOS). Both diseases are marked by a multifactorial damage of endothelial cells that leads to endothelial inflammatory reactions and thus organ damage. The polyclonal antibody anti-thymocyte-globulin-Fresenius (ATG-F) is used as prophylaxis against GVHD, while Defibrotide (DF) is used as prophylaxis against VOD/SOS. The effects of ATG-F and DF on endothelial cells have yet not been experimentally tested to a sufficient extent. In this work the hypothesis that ATG-F can inhibit endothelial functions and thus impair neovascularization was tested. Secondly, the hypothesis that DF can stimulate endothelial functions and thus promote endothelial regeneration was tested. METHODS: Three in vitro assays were used to test the effects of ATG-F and DF on human umbilical vein endothelial cells (HUVECS): 1) the scratch assay measures endothelial proliferation and migration; 2) the MTT assay measures endothelial proliferation rates; and 3) the tube formation assay measures the angiogenic activity of RESULTS: ATG-F can significantly inhibit endothelial proliferation and migration in the scratch assay and can dose-dependently inhibit proliferation rates in the MTT assay. ATG-F showed no significant effects on the angiogenic activity in the tube formation assay. DF can significantly inhibit proliferation rates in the MTT assay and the angiogenic activity in the tube formation assay, both dose-dependently. DF showed no effects on endothelial proliferation and migration in the scratch assay. CONCLUSION: Our findings demonstrate previously unknown effects of ATG-F and DF, two standard drugs used in the field of allo-HSCT, on endothelial cells. Both tested drugs show inhibitory effects on the function of endothelial cells in a dose-dependent manner. These findings may have implications for therapies targeting the endothelium. In the early phases after allo-HSCT, both ATG-F and DF could have a positive effect by inhibiting the pathological GVHD-associated neovascularization, and thus leading to a reduced severity of acute GVHD. However, in later phases after allo-HSCT, the inhibitory effects of ATG-F and DF on endothelial functions may impair endothelial regeneration and thus promote endothelial damage. This might lead to in an increase of endothelium-associated complications after allo-HSCT, such as microangiopathy, chronic GVHD, and VOD/SOS