Bioprozessentwicklung der AMDase katalysierten Synthese von Arylpropionsäure Derivaten

Die biokatalytische Prozessführung für enantiomerenreine Produkte stellt eine vielversprechende und umweltfreundliche Alternative zu herkömmlichen chemischen Synthesewegen dar und findet vermehrt Anwendung. Im Fokus der vorliegenden Arbeit lag die Bioprozessentwicklung für die enzymkatalysierte Synthese von Arylpropionsäuren, wie Ibuprofen oder Naproxen. Der enantioselektive Syntheseschritt wird durch die Arylmalonat Decarboxylase (AMDase) realisiert, welche die Decarboxylierung von aromatischen Dicarbonsäure Derivaten in einer einfachen einstufigen Reaktion katalysiert. Eine Herausforderung war hierbei, die sehr geringe enzymatische Stabilität zu verbessern. Durch Immobilisierung an einen robusten Acrylatträger konnte die Halbwertszeit über 170-fach von 1,2 h auf 8,6 Tage gesteigert werden und so die Produktivität deutlich erhöht werden. Die Immobilisierung des Enzymes aus dem Zelllysat brachte zudem eine Zeit- und Kostenersparnis, da eine Enzymaufreinigung eingespart werden kann. Die kinetische Charakterisierung des immobilisierten Enzymes in Hinsicht auf die Naproxenmalonsäure Umsetzung zeigten einen KM von 22,1 ± 0,1 mM mit einer Aktivitätsausbeute von 40 % gegenüber der Analysen mit freiem Enzym. Der leicht inhibierende Effekt des gebildeten Produktes (Ki von 26,3 ± 1,4 mM) führte zur Wahl eines Batch-Modus für die Hochskalierung der Reaktion. Der entwickelte Bioprozess konnte in der Synthese von (S) Naproxen im präparativen Maßstab in zwei verschiedenen Rührkesselreaktoren erfolgreich realisiert werden. In einem normalen, in welchem das immobilisierte Enzym frei in der Reaktionslösung vorliegt und in einem rotierenden Festbettreaktor, in welchem das immobilisierte Enzym durch einen Gittereinsatz im Rührerelement von der Reaktionslösung getrennt vorliegt. In beiden Rührkesselreaktoren konnten mit Umsätzen von über 99,9 % in fünf wiederholten Anwendungen enantiomerenreines (S)-Naproxen mit einer Produktivität von über 140 kg(S)-Naproxen/kgEnzym hergestellt werden (ee 99 %). Nach Produktisolation durch einfache säureinduzierte Fällung und anschließender Trocknung wurden 92 % isolierte Ausbeute an reinem (S)-Naproxen gewonnen.Biocatalytic process design for the synthesis of enantiopure products is a promising and environmentally friendly alternative to conventional chemical synthesis routes and will increasingly be used in industry. The focus of this dissertation was the bioprocess development of an enzye catalyzed synthesis of arylpropionates, such as Ibuprofen or Naproxen. The enantioselective step of synthesis is, for this purpose, performed by the Arylmalonate Decarboxylase (AMDase), which catalyzes the enantioselective decarboxylation of aromatic dicarbonic acids in a simple one-step reaction. The challenge here was to increase enzymatic stability under process conditions. Through immobilization onto a robust acrylic carrier, a 170-fold increase of stability was achieved, as well as an observed increase in the half-life of the free enzyme from 1.2 hours to a half-life of about 8.6 days of the immobilized enzyme with improved productivity. Additionally, the successful immobilization of the cell lysate led to the decrease in time and money spent on the process –as the enzyme purification step was not necessary anymore– and reveals a more stable enzyme preparation for the bioprocess. The kinetic characterization of the immobilized enzyme in respect of naproxen malonic acid conversion reveals a KM of 22.1 ± 0.1 mM with an activity yield of about 40%. The slightly inhibiting effect of the product (Ki of 26.3 ± 1.4 mM) led to the selection of a batch mode for this bioprocess. The preparative synthesis was realized in two stirred tank reactors. One, in a usual reactor where the immobilized enzyme is freely suspended in the reaction solution, and the other, in a rotating fixed bed reactor in which the enzyme was separated from the reaction mixture located in the stirrer element. In both stirred tank reactors, the synthesis of enantiopure (S)-naproxen (ee 99%) was realized in five repeated batch experiments with a productivity of 140 kg(S) Naproxen/kgAMDase-CLGIPL. After product isolation, by an easy acid induced product precipitation and subsequent product-drying, a yield of 92% of enantiopure (S)-naproxen was achieved