Using Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers (PMOs) to characterize the role of neurofibromin in cell physiology

The role of neurofibromin, the product of the Neurofibromatosis Type 1 (NF1) gene, in cell physiology is still not well understood. Considering the different traits associated to NF1 it is clear that neurofibromin participates in processes of proliferation and differentiation of different cell types. The Ras-GAP activity of neurofibromin is its best characterized biochemical function, which is regulated by the alternative splicing of exon 23a (E23a). In this thesis we intended to better understand the role of alternative splicing of E23a during neuronal differentiation, with the aim that in the future it could provide information on the learning and cognitive issues related to this disease. Due to the large size of neurofibromin, the difficulty of manipulating it in vitro and the necessity to mimic, as much as possible, the physiological conditions of the cell, we used Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers (PMOs) to modify the exonic composition of NF1 mRNA while preserving the endogenous neurofibromin expression levels. We developed a PMO-based system that successfully allowed to force the expression of type II (+E23a) or type I (-E23a) isoforms without altering the physiological expression levels of NF1 mRNA in PC12 cells, a neuronal differentiation model, in the presence or absence of Nerve Growth Factor (NGF). This PMO system could be used in other cellular models of NF1, and could be reproduced for studying the regulation of the alternative splicing in other genes. Furthermore, we set up a group of functional assays for assessing proliferation, differentiation, signaling and apoptosis in this PC12 neuronal model. Our results showed that forcing type I (-E23a) isoform was not sufficient for inducing PC12 neuronal differentiation in the absence of NGF. However, the results also demonstrate that any alteration of the NGF-induced ratio between type I/II isoforms, either in a quantitative or time-dependent manner, interfered with the correct neuronal differentiation process, in particular, altering the correct formation of neurites, as well as the proper regulation of the RAS/MAPK and cAMP/PKA signalling pathways. Moreover, the alteration of the natural E23a alternative splicing also impeded the proper neuronal differentiation process in other neuronal models, such as the H19-7 hippocampus cells. Our results also showed that the depletion of neurofibromin in PC12 induce a generalized process of apoptosis; suggest the existence of an early negative feed-back on the function of neurofibromin when type I isoform is abnormally expressed, and shows that the regulation of the cAMP/PKA pathway is also dependent on the GAP domain of neurofibromin. All together, the results of this thesis indicate that the regulation of the alternative splicing of exon 23a of the NF1 gene allows the fine-tuning of the RAS/MAPK and cAMP/PKA pathways through its GAP activity in a coordinate and opposite way along the time-dependent process of neuronal differentiation.La neurofibromina és el producte del gen NF1, que mutat causa la Neurofibromatosis de tipus 1. Tot i que en l'actualitat, encara ens cal entendre millor el rol d'aquesta proteïna en la fisiologia cel•lular, l'activitat Ras-GAP és la funció bioquímica més ben caracteritzada de la neurofibromina. Aquesta funció està regulada per l'splicing alternatiu de l'exó 23a (E23a). En aquesta tesi ens vàrem proposar comprendre millor el paper d'aquest splicing alternatiu durant el procés de diferenciació neuronal, amb l'objectiu de proporcionar nova informació sobre els problemes cognitius i d'aprenentatge associats a aquesta malaltia. Degut a la gran grandària de la neurofibromina i a la dificultat de manipular-la in vitxo, es varen utilitzar Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers (PMOs) per modificar la composició exònica del mARN (per tant l'estructura resultant de la neurofibromina) sense alterar les condicions fisiològiques d'expressió del gen NF 1 . Es va desenvolupar un sistema basat en PMOs per forçar l'expressió de l'isoforma tipus II (+E23a) o tipus I (-E23a) del gen NF1 en cèl•lules PC12, un model de diferenciació neuronal, en presència o absència de Nerve Growth Factor (NGF). A més, per entendre la importància de 1'E23a es va establir un grup de metodologies i assajos funcionals per poder determinar diferents respostes cel•lulars i valorar la funció d'aquest en el procés de diferenciació neuronal. Els nostres resultats van mostrar que forçar l'isoforma tipus I (-E23a) no era suficient per induir la diferenciació de les cèl•lules PC12 en absència de NGF. No obstant això, qualsevol alteració en la relació entre les isoformes tipus I/II en presència de NGF, ja sigui d'una manera quantitativa o dependent del temps, interferia en el correcte procés de diferenciació neuronal, en particular, alterant la correcta formació de neurites, així com l'adequada regulació de les vies de senyalització RAS/MAPK i cAMP/PKA. En conjunt, els resultats d'aquesta tesi indiquen que la regulació de l'splicing alternatiu de 1'E23a del gen NF1 permet un ajust fi de les vies RAS/MAPK i cAMP/PKA a través de la activitat GAP de la neurofibromina, d'una forma oposada i coordinada al llarg del temps durant el procés de diferenciació neuronal