Characterization of two metallocarboxypeptidases of M14D subfamily from bacterial and human origin

Las metalocarboxipeptidasas (MCP) de la familia M14 catalizan la hidrólisis de aminoácidos del C-terminal de proteínas y péptidos. Nuestro grupo describió la subfamilia M14D o carboxipeptidasas citosólicas (CCP) a partir de búsquedas genómicas de secuencias aminoacídicas similares a CCP1 o Nna1 (Nervous system nuclear protein induced by axotomy, por sus siglas en Inglés). Se identificaron CCPs en cerca de 100 bacterias Gram negativas, generalmente con una única copia del gen. Las CCPs bacterianas tiene una arquitectura de dominios más simple que consiste en el dominio amino terminal (N-dominio) y el dominio carboxipeptidasa (dominio CP). En humanos hay seis genes parálogos (CCP1-CCP6) y además de los dominios N- and CP- contienen extensiones adicionales en ambos extremos. Estas proteínas son muy complejas y difíciles de manipular experimentalmente. La principal función de las CCPs de Eucariotas parece ser el procesamiento de modificaciones postraduccionales en el C-terminal de las tubulinas como las cadenas laterales de ácidos poliglutámicos o el ácido glutámico codificado en la cadena principal. La CCP1 humana además procesa los C-terminales ácidos de otras proteínas. Estos segmentos participan en interacciones moleculares y por tanto la CCP1 podría regular estas interacciones. Estudios filogenéticos y de localización intracelular sugieren que las funciones de las CCPs de Eucariotas pudieran estar relacionadas con los cilios y los cuerpos basales aunque no se conocen bien muchos de los mecanismos moleculares involucrados. Las CCPs de Procariotas han sido muy poco caracterizadas desde el punto de vista bioquímico y funcional. El presente trabajo ha aportado más información de las características estructurales y funcionales de la familia M14D, utilizando como modelos la CCP de Pseudomonas aeruginosa (PaCCP) y la CCP6 humana (hCCP6). Se determinó la estructura cristalográfica de PaCCP que tiene un novedoso dominio N-terminal tipo β-sandwich y un dominio CP clásico tipo α/β-hidrolasa. La mayoría de los residuos del centro activo están bien posicionados, sin embargo no se detectó actividad enzimática utilizando diferentes sustratos. Esto sugiere que PaCCP pudiera estar en una forma inactiva o que la activación requiere la presencia de su sustrato(s) específico(s) y/o un regulador alostérico. La co-cristalización de PaCCP con inhibidores de MCPs sugiere que la enzima podría necesitar un reordenamiento estructural para ser activa. La estructura de PaCCP permitió modelar las CCPs de mamíferos que conservan el plegamiento global de los dominios N- y CP- y la posición de los residuos claves. Se caracterizó una cepa de P. aeruginosa deficiente en PaCCP (Δpaccp) para explorar posibles mecanismos funcionales. La producción de PaCCP fue dependiente de la densidad celular sugiriendo una relación con el “Quorum Sensing” (QS). La cepa Δpaccp mostró mayor actividad proteolítica extracelular y movilidad “swarming”, menor formación de biofilm y una pérdida total de la movilidad “twitching” (TM). Demostramos que la ausencia de TM se debió a bajos niveles intracelulares de PilA, la proteína estructural del pili. Se propone que PaCCP pudiera regular la expresión de pilA y posiblemente otros genes en la bacteria. La cepa Δpaccp resultó ser menos virulenta en el modelo “slow killing” de C. elegans, lo que apunta a un papel de PaCCP en la patogénesis de P. aeruginosa. hCCP6 mostró la misma actividad deglutamilasa de las tubulinas que el ortólogo en ratón. La proteína actuó específicamente sobre la α-tubulina lo que podría representar un mecanismo de regulación de las CCPs. hCCP6 hidrolizó los ácidos glutámicos en el C-terminal de la proteína TRAFD1, un sustrato de CCP1, aunque habría que determinar si es un sustrato natural. La actividad de hCCP6 es inhibida por agentes quelantes y no por inhibidores proteicos de CP. Estudios de interactómica permitieron identificar proteínas que potencialmente interactúan con PaCCP y hCCP6. Algunas se proponen para una futura validación lo que contribuirá a la mejor comprensión de las relaciones funcionales de estas enzimas.Metallocarboxypeptidases (MCP) of M14 family catalyze the hydrolysis of C-terminal amino acid residues in protein and peptide substrates. Recently, our group described the M14D subfamily or cytosolic carboxypeptidases (CCPs) after genomic searching of aminoacidic sequences similar to CCP1 or Nna1 (nervous system nuclear protein induced by axotomy). CCPs were identified in around 100 Gram-negative bacteria that usually contain one gene copy. The domains architecture of bacterial CCPs is simpler, consisting in the amino-terminal (N-domain) and the carboxypeptidase domain (CP domain) both conserved in the subfamily. In humans there are six paralogous genes (CCP1-CCP6) and, besides the N- and CP-domains, they contain additional extensions at the N- and/or the C-terminus. At the protein level, they are quite complex, labile and difficult to express and handle experimentally. It has been proposed a primary function for eukaryotic CCPs in processing the C-terminal posttranslational modifications of tubulins, including the glutamates side chains and the encoded glutamate. Additionally, human CCP1 shortens acidic tails, implicated in molecular interactions, from other proteins; therefore it has been proposed a general function in the regulation of protein‐protein and protein‐DNA interactions. Recently, evidence from phylogenetic analysis and cellular localization suggests that eukaryotic CCPs functions could be related to cilia and basal bodies. Nevertheless, many of the molecular mechanisms underlying the proposed functions remain unclear. On the other hand, prokaryotic CCPs are poorly characterized from the biochemical and functional point of view. The present work aimed to provide more information on key structural and functional features of M14D subfamily using the CCP from Pseudomonas aeruginosa (PaCCP) and the human CCP6 (hCCP6) as models. The crystal 3D structure of recombinant PaCCP was solved showing a novel β-sandwich N-terminal domain followed by a well defined α/β-hydrolase CP domain. Although most residues seem to be well positioned in the active-site, no activity against a wide array of substrates was detected. This suggests that PaCCP is in an inactive form or requires a very specific substrate(s) and/or an alosteric molecule to display the CP activity. Co-crystallization experiments with inhibitors, traditionally used for M14Aand M14B MCPs, indicate that the enzyme might require structural rearrangements to be active. The structure of PaCCP provides a first detailed structural insight into mammalian CCPs evidencing a conserved global fold of the N- and CP-domains and the position of key residues. The functional processes involving PaCCP in P. aeruginosa were explored by characterizing a mutant strain deficient in the protein (Δpaccp). PaCCP production was dependent of cellular density suggesting a relation with Quorum Sensing (QS). Δpaccp strain showed increased extracellular proteolytic activity and swarming motility, decreased biofilm formation and a complete loss of twitching motility (TM). We have also demonstrated that intracellular low levels of pilin structural protein, PilA, prevented TM. It is proposed that PaCCP could be involved in the regulation of the expression of pilA and possibly other genes in P. aeruginosa. Decreased virulence of Δpaccp assayed in the C. elegans “slow killing” model pointed a role of PaCCP in P. aeruginosa pathogenesis. hCCP6 was produced in mammalian cells and showed the same deglutamylating activity on tubulins as a mouse ortholog. The protein acted specifically on α-tubulin what could represent a regulatory mechanism of CCPs activity. hCCP6 was able to hydrolyze the C-terminus glutamates stretch of TRAFD1, a substrate of CCP1, although it should be determined whether it is a natural substrate. The enzymatic activity of hCCP6 was inhibited by chelating agents but not by proteinaceus CP inhibitors. Interactomic assays have been performed and potential interacting partners of PaCCP and hCCP6 were identified. Some of them are proposed for further validation, which will contribute to a better understanding f the functional relationships of these enzymes