Contribució de la citogenètica molecular i les tècniques d’estimulació i separació cel·lular a l’estudi de les neoplàsies hematològiques limfoides d’origen B

L’estudi citogenètic de les neoplàsies hematològiques és de gran importància en la pràctica clínica des del punt de vista diagnòstic, pronòstic i patogenètic. La identificació d’alteracions citogenètiques en les proliferacions limfoides és dificultosa degut al baix índex mitòtic dels limfòcits B madurs, a l’obtenció de metafases normals sovint no corresponents a la clona maligna o amb d’alteracions submicroscòpiques/críptiques impossibles d’identificar en metafase mitjançant les tècniques de bandeig G, i a la mala qualitat cromosòmica de les proliferacions agudes. Mitjançant les tècniques d’estimulació i separació cel·lular i la hibridació in situ fluorescent (FISH) s’han estudiat diferents neoplàsies que es desenvolupen al llarg de la limfopoesi B com la leucèmia limfoblàstica aguda B (LLA-B), la leucèmia limfàtica crònica (LLC), i neoplàsies de cèl·lules plasmàtiques (CP) com la gammapatia monoclonal de significat incert (GMSI) i el mieloma múltiple (MM). En la LLA-B s’han identificat dues translocacions amb implicació del gen IGH no descrites fins al moment. Són la t(2;14)(q14.3;q32) i la t(14;17)(q32;q21) i contribueixen a la formació d’un nou subgrup de pacients en la classificació de la WHO. En la LLC s’ha comparat la FISH interfàsica (I-FISH) en cultius de sang perifèrica estimulats amb phorbol-12-myristate-13-acetate (TPA) i en cèl·lules mononucleades deseparades per gradient de densitat (CMGD) per a la detecció d’alteracions cromosòmiques. La I-FISH-TPA ha incrementat el percentatge de nuclis patològics i ha identificat més alteracions que la I-FISH-CMGD i s’ha observat que la I-FISH-TPA és especialment útil en els pacients amb un recompte de limfòcits baix. A més, s’ha avaluat la supervivència lliure de tractament (SLT) i la supervivència global, i s’ha observat que la I-FISH-TPA prediu millor la SLT que la I-FISH-CMGD, incrementant el valor pronòstic de la I-FISH. També els cultius estimulats amb TPA han permès analitzar la metafase i caracteritzar les delecions 13q14 identificada mitjançant I-FISH-TPA. S’ha observat que les delecions 13q14 monoal·lèlica i submicroscòpica són les més freqüents. Les delecions grans s’observen únicament dins les monoal·lèliques i les submicroscòpiques associades a translocació són més freqüents dins les bial·lèliques i semblen degudes a evolució clonal. S’han identificat quatre translocacions 13q14 no descrites fins al moment amb deleció associada. Aquestes són la der(1)t(1;13)(q21;q14)inv(1)(q42q21), la t(1;5;13)(p36;q31;q14), la t(9;13)(q31;q14-21) i la t(10;13)(p14-15;q12). En les neoplàsies de CP s’ha realitzat la I-FISH en CP (I-FISH-CP) separades amb partícules immunomagnètiques MACS i, en els casos amb delecions 13q, s’ha comparat la detecció de les alteracions respecte la I-FISH en cultius de MO (I-FISH-MO). El percentatge de nuclis patològics observat mitjançant I-FISH-CP és superior que en I-FISH-MO, la qual només detecta el 26% dels casos patològics. Es conclou que la I-FISH-CP és la tècnica d’elecció per a la detecció de les alteracions especialment en casos amb baixa infiltració de CP en MO.Cytogenetic studies in haematological malignancies are important in clinical practice from the diagnostic, prognosis to pathogenetics point of view. The Identification of chromosomal aberrations in lymphoid proliferations is hampered by the low mitotic index of mature B-cells, the presence of normal metaphases that frequently do not correspond to the malignant clone or hidden submicroscopic/cryptic deletions that escape from G-banding resolution, and poor chromosome quality in acute proliferations. Using cell stimulation and separation techniques and fluorescence in situ hybridisation (FISH) we have studied several lymphoid neoplasms that develop along B-cell lymphopoiesis such as B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemia (BCP-ALL), chronic lymphocytic leukaemia (CLL), and plasma cell neoplasms such as monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) and plasma cell myeloma (MM). In BCP-ALL, we have identified two novel translocations involving the IGH gen located at 14q32, namely t(2;14)(q14.3;q32) and t(14;17)(q32;q21), and contribute to the formation of a new group of patients in the WHO classification. In CLL, we have compared interphase FISH (I-FISH) on cultured peripheral blood (PB) stimulated with phorbol-12-miristate-13-acetate (TPA) and on PB mononuclear cells separated by density gradient (PBMC) for the detection of chromosomal aberrations. I-FISH-TPA has increased the percentage of abnormal nuclei and the detection of chromosome abnormalities compared to I-FISH-PBMC. We have observed that I-FISH-TPA is especially useful in patients with low lymphocyte count. Additionally, we have evaluated treatment-free survival (TFS) and overall survival (OS) and we observed that I-FISH-TPA provided a better prediction of TFS and OS than I-FISH-PBMC, improving the prognostic value of I-FISH. Moreover, TPA-stimulated cultures have allowed to analyse metaphases and the characterization of 13q14 deletions identified by I-FISH-TPA. We observed that the most frequent deletions are monoallelic and submicroscopic deletions. Large deletions are only observed within the monoallelic group, and translocation-associated deletions are more frequent in the biallelic group, which seems to be related to clonal evolution. Among these cases we identified four 13q translocations with deletion not previously described such as der(1)t(1;13)(q21;q14)inv(1)(q42q21), t(1;5;13)(p36;q31;q14), t(9;13)(q31;q14-21) and t(10;13)(p14-15;q12). In plasma cell neoplasms, we have performed I-FISH on plasma cells (PC) isolated by MACS immunomagnetic beads, and in cases with 13q deletion, we have analysed with I-FISH bone marrow cultures (BM) for the detection of 13q abnormalities. The percentage of abnormal nuclei observed by I-FISH-PC was higher than I-FISH-BM, which only detects the 26% of abnormal cases. Consequently, I-FISH-PC is the technique of choice for the detection of chromosomal abnormalities especially in those cases with low PC infiltration in BM