Mitochondriopathien als Ursache des renalen Fanconi-Syndroms

Das renale Fanconi-Syndrom wird definiert als Einschränkung des proximal tubulären Transports und kann durch eine Vielzahl von Faktoren ausgelöst werden. Neben sogenannten sekundären Formen als Folge einer anderen Erkrankung oder als Nebenwirkung einer therapeutischen Behandlung gibt es auch primäre Formen, die als direkte Konsequenz einer Mutation auftreten. In dieser Arbeit sollten zwei dieser Formen untersucht werden, die beide autosomal dominant vererbt werden. Zum einen handelt es sich dabei um das peroxisomale Protein EHHADH, das dort an der β-Oxidation beteiligt ist. Zum anderen um FAP2, einen Bestandteil der Kreatin-Synthese. Für EHHADH war bereits bekannt, dass es im späten proximalen Tubulus der Niere exprimiert wird. Dieses Ergebnis wurde mit Hilfe zweier weiterer Antikörper bestätigt. Sowohl die Immunfluoreszenz mit einem weiteren Antikörper gegen EHHADH als auch mit einem Antikörper gegen das peroxisomale Protein D-Amino acid oxidase ergab ein Signal im corticalen Bereich der Niere im spät-proximalen Tubulus (S2/S3-Segment). Die beobachtete granuläre Verteilung stand im Einklang mit der Verteilung der Peroxisomen. Dies ließ den Schluss zu, dass EHHADH in den Peroxisomen des spät-proximalen Tubulus exprimiert wird. In Vorarbeiten konnte nachgewiesen werden, dass mutiertes EHHADH zusätzlich in die Mitochondrien importiert wird. Die genaue intramitochondriale Lokalisation wurde elektronenmikroskopisch mit Hilfe der ReAsH-Methode untersucht. Bei den mit EHHADHWT transfizierten Zellen waren nur die Peroxisomen positiv. In den Mitochondrien war kein Niederschlag erkennbar. Im Gegensatz dazu hatten mit EHHADHMUT transfizierte Zellen sowohl positive Peroxisomen als auch Mitochondrien. In meiner Diplomarbeit habe ich festgestellt, dass der mitochondriale Import von EHHADH eine Beeinträchtigung der oxidativen Phosphorylierung zur Folge hat. Um zu überprüfen, ob sich dies analog zu den Fanconi-Patienten tatsächlich auf den transzellulären Transport auswirkt, wurde auf Filtern gewachsenen Zellen das Glucose-Derivat α-D-Methylglucosid angeboten. Dies wird von Na+-Glucose-Cotransportern transportiert, in den Zellen jedoch nicht umgesetzt. Dabei zeigte sich, dass die EHHADHMUT-Zellen nur rund ein Viertel der Transportkapazität der Wildtypzellen hatten. Diese Daten erlauben nun neue Einblicke in die Pathogenese dieses speziellen Fanconi-Syndroms. EHHADHMUT wird fälschlicherweise in die Mitochondrien importiert, wo es die mitochondriale β-Oxidation beeinträchtigt. Dies führt schlussendlich zu einer verringerten ATP-Synthese und einer erniedrigten Transportkapazität im proximalen Tubulus der betroffenen Patienten. Bei FAP2 handelt es sich im Gegensatz zu EHHADH um ein genuines mitochondriales Protein. Die Lokalisation in der Niere konnte auf den frühen proximalen Tubulus eingegrenzt werden, wo es in den Mitochondrien lokalisiert war. Spät-proximale Tubuli sowie medulläre Segmente waren negativ für FAP2. Mit Hilfe einer stabil transfizierten Zelllinie wurde eine Mutation im FAP2-Gen näher untersucht. Zellen, welche FAPWT überexprimierten, wiesen einen relativ milden Phänotyp auf. Die Mitochondrien erschienen fragmentiert und geschwollen, was in der Elektronenmikroskopie bestätigt wurde. Dies ist vermutlich der Überexpression von FAP2WT und dem damit verbundenen vermehrten Import von FAP2WT in die Mitochondrien geschuldet. Zellen, die FAP2MUT überexprimierten, enthielten massiv veränderte Mitochondrien. Die Mitochondrien waren stark elongiert und durchzogen die gesamte Zelle. In der Elektronenmikroskopie waren in den Mitochondrien der FAP2MUT-Zellen filamentartige Strukturen erkennbar. Mit Hilfe der Immuno-Gold-Markierung konnte die Beteiligung von FAP2MUT am Aufbau der Filamente nachgewiesen werden. Die Halbwertszeit des mutierten FAP2-Proteins war drastisch verlängert. Dies deutet darauf hin, dass das in Filamenten befindliche FAP2MUT-Protein nicht mehr normal degradiert werden konnte. Trotz der massiv veränderten Mitochondrienmorphologie konnte in respiratorischen Messungen der oxidativen Phosphorylierung kein deutlicher Unterschied zwischen FAP2WT- und FAP2MUT-Zellen beobachtet werden. Das Fanconi-Syndrom scheint bei diesen Patienten also nicht durch eine Einschränkung der Energiebereitstellung verursacht zu werden. Zudem konnte eine Biopsie einer Patientenniere untersucht werden. Eine Hämalaun/Eosin-Färbung ergab gut erhaltene distale Segmente und Glomeruli. Die proximalen Abschnitte Zeichen einer tubulären Schädigung. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen waren in den proximalen Tubuluszellen ebenfalls Riesenmitochondrien erkennbar, die filamentartige Einschlüsse enthielten. Diese Befunde legen nahe, dass das Auftreten der intramitochondrialen Ablagerungen kein Zellkulturartefakt ist, sondern diese filamentartigen Strukturen auch in vivo am Entstehen der Erkrankung beteiligt sind. Das beobachtete Fanconi-Syndrom sowie die Niereninsuffizienz scheinen jedoch nicht die Folge einer beeinträchtigten oxidativen Phosphorylierung zu sein. Der zu Grunde liegende Pathomechanismus konnte jedoch noch nicht aufgeklärt werden. Die in dieser Arbeit untersuchten Formen des renalen Fanconi-Syndroms entstehen beide in Folge einer Mitochondriopathie. Während im Falle der EHHADH-Mutation eine verminderte Energiebereitstellung krankheitsauslösend zu sein scheint, sind die Pathomechanismen bei FAP2 komplexer und bedürfen weiterführender Untersuchungen, für die die hier dargestellten Befunde eine Ausgangsbasis bilden