Charakterisierung der Transkriptionsregulatoren TrmB und TrmBL1 im Metabolismus des Archaeons Pyrococcus furiosus

Die Hypothese zur differenziellen Bindefähigkeit von TrmB und TrmBL1 an den TM- und MD-Promotor via verschiedener Bindehelices konnte durch in vitro Transkriptionen mit Proteinen, in denen die beiden betroffenen Helices vertauscht wurden, nur für den TM-Promotor bestätigt werden. Für den MD-Promotor blieben die erwarteten Resultate aus oder trafen nur bedingt zu. Aufgrund neuerer Strukturdaten zu TrmB wird nun vermutet, dass eine Regulation der beiden Promotoren nicht über verschiedene Helices stattfindet, sondern eher auf den verschiedenen Konformationen der Proteine beruht. Nähere Daten dazu sind jedoch bisher nicht bekannt. Mit Hilfe des an diesem Lehrstuhl von Frau Dr. Ingrid Waege etablierten Systems wurde eine Simvastatinresistenzkassette in Pyrococcus furiosus eingebracht sowie eine TrmBL1-Deletionsmutante mit der gleichen Antibiotikaresistenz erstellt. Anschließend wurde das Wachstumsverhalten der trmBL1-Deletionsmutante gegenüber dem Simvastatin-resistenten Wildtyp in 1/2-SME-Medium mit je 0,1 % Stärke, Hefeextrakt und Pyruvat untersucht. Dieses zeigte keine Unterschiede der beiden Stämme. Sowohl der Wildtyp als auch die Deletionsmutante vermehrten sich mit nahezu gleicher Wachstumsrate und erreichten annähernd gleiche Zelldichten. Durch ChIP-Seq-Versuch von Robert Reichelt wurde im Laufe dieser Arbeit jedoch festgestellt, dass der als Wildtyp bezeichnete Stamm eine Deletion der Gene pf1737 bis pf1751 besitzt. Somit ist auch das Gen für TrmB deletiert. Der "Wildtyp"-Stamm ist daher bereits eine trmB-Deletionsmutante und die neu etablierte trmBL1-Deletionsmutante somit eine Doppelmutante. Umso erstaunlicher ist, dass unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen trotzdem kein Unterschied im Wachstums-verhalten festgestellt werden konnte. Nur ein Vergleich der Phänotypen zeigt, dass die Doppelmutante kleinere Zellen hervorbringt. Weitere Versuche mit veränderten Medienkompositionen könnten hier einen entscheidenden Unterschied im Wachstumsverhalten bringen. In dieser Arbeit durchgeführte in vitro Versuche zur Regulation durch TrmBL1 an neu gefundenen Promotoren konnten bestätigen, dass TrmBL1 auch an der Regulation des Metabolismus außerhalb des Zuckerstoffwechsels beteiligt ist. In EMSA-Experimenten konnte eine Bindung von TrmBL1 an alle Promotoren, bei denen auch in vivo eine Bindung gefunden wurde, nachgewiesen werden. Zudem konnte an allen getesteten Promotoren (bis auf pf0287 und pf0648 mit einem TGM stromaufwärts der BRE/TATA-Box) in vitro eine Hemmung oder Aktivierung der Transkription gefunden werden. Auch das bereits bekannte Schema mit Bindung an das TGM und die nach dessen Lage daraus resultierende Aktivierung oder Repression der Transkription durch TrmBL1 konnte an den Promotoren nachgewiesen und durch DNaseI Footprinting Analysen die Wichtigkeit des TGM an der Regulation der Promotoren bekräftigt werden. Bei der Untersuchung des vermuteten Transkriptionsfaktors aMBF1 konnte in EMSA-Versuchen festgestellt werden, dass keine direkte Bindung von aMBF1 an die DNA erfolgt. Erste in vitro Transkriptionsversuche mit dem Transkriptionsfaktor ergaben jedoch, dass dieser durchaus in der Lage ist, die Transkriptionsaktivität zu steigern. An manchen Promotoren sogar um das 2,7-fache der basalen Transkriptionsaktivität. Die Hypothese, dass aMBF1 durch Wechselwirkung mit TrmBL1 an der Aktivierung der Transkription von Promotoren mit TGM stromaufwärts der BRE/TATA-Box beteiligt ist, konnte jedoch nicht bestätigt werden