Methodische Entwicklungen zur Hochdruck-Kernspinresonanzspektroskopie sowie druckabhängige Untersuchungen an Oozyten von Xenopus laevis und Modellpeptiden

Grundvoraussetzungen für die Messung druckinduzierter Änderungen thermodynamischer Parameter mittels Kernspinresonanzspektroskopie sind die Verlässlichkeit sowie die Präzision der verwendeten Hochdruckapparaturen. Die Neukonstruktion des Autoklaven, welcher den druckdichten Zusammenschluss des Probenröhrchens mit der Hochdruckleitung der Druckerzeugungseinheit darstellt, gewährleistet die kontaminationslose Applikation hoher hydrostatischer Drücke auf die Probe. Das kommerziell nicht verfügbare, automatisierte sowie in die Steuerung des NMR-Spektrometers integrierte Druckregelsystem ermöglicht das völlig autonome Erheben hochaufgelöster Datensätze druckabhängiger Observablen in Kernspinresonanzexperimenten mit größtmöglicher Zeiteffizienz. Durch die eigens entwickelte Kommunikation zwischen der Spektrometerkonsole und der Druckerzeugungseinheit, konnte die Steuerung des Druckverlaufs auf den Spektrometerrechner übertragen werden. Mit der neu konzipierten sowie realisierten Drucksprungeinrichtung lassen sich schnelle Druckänderungen bis 200 MPa innerhalb von 12 ms erzeugen. Dies stellt eine beachtliche Beschleunigung der Druckänderung um bis zu einen Faktor 4 gegenüber der Anlage aus dem Jahre 2002 dar. Folglich wird die Zeitskala der möglichen Aufklärung dynamischer Prozesse biochemisch aktiver Makromoleküle signifikant erweitert. Das dabei erarbeitete Grundlagenwissen über die Druckausbreitung innerhalb der Anlage half ganz entscheidend, die gesetzten Ziele zu erreichen. Neben der neu geschaffenen Fähigkeit eines Sprunges zwischen zwei beliebigen Druckniveaus, mittels vorab mit Druck beaufschlagter Reservoire, konnte zudem die Bedienbarkeit des Gesamtsystems enorm erhöht werden. Dieses, ebenfalls vom NMR-Spektrometer gesteuerte System, garantiert die exakte Wiederholung definierter Druckänderungen über die Dauer der großen Wiederholraten der Experimente. Durch die Verwendung terminal geschützter Random-Coil-Peptide konnte der druckabhängige Einfluss geladener Gruppen auf die Druckantworten gemindert werden. Die größ-ten Druckabhängigkeiten sowohl erster als auch zweiter Ordnung der 1H chemischen Ver-schiebung werden bei den Amidprotonen des Rückgrates entdeckt. Ihre Mittelwerte betra-gen 0,523 ppm GPa-1 sowie -0,41 ppm GPa-2. Die stärkste Druckantwort erster Ordnung be-sitzt Threonin mit 0,755 ± 0,024 ppm GPa-1. Den am meisten gekrümmten Verlauf der Druckabhängigkeit zeigt Tyrosin mit -0,82 ± 0,25 ppm GPa-2. Die geringste druckinduzierte Änderung der chemischen Verschiebung von Amidprotonen weist Glycin mit 0,239 ± 0,012 ppm GPa-1 auf. Bei den Hα-Protonen sind Mittelwerte der beiden Druckkoeffizienten B1 und B2 von 0,034 ppm GPa-1 beziehungsweise 0,029 ppm GPa-2 messbar. Im Gegensatz zu den Amidprotonen ist hier eine druckinduzierte Änderung der chemischen Verschiebung sowohl in Richtung Tief- als auch in Richtung Hochfeld zu verzeichnen. Die stärksten Effekte erster Ordnung sind demnach in Glycin mit 0,077 ± 0,003 ppm GPa-1 und in Leucin mit 0,132 ± 0,016 ppm GPa-1 zu finden. Den geringsten Absolutwert der linearen Druckabhängigkeit weist Prolin in trans-Konformation auf (-0,0061 ± 0,0004 ppm GPa-1). Die stärkste Rechtskrümmung des Druckverlaufes der Resonanzfrequenz der Hα-Protonen zeichnet Glutamat (-0,198 ± 0,030 ppm GPa-2) aus, die stärkste Linkskrümmung Tyrosin (0,221 ± 0,048 ppm GPa-2). Am insgesamt stabilsten gegenüber Druckvariation erweisen sich die Resonanzfrequenzen von Cystein Hβ2/β3 und Threonin Hβ mit -0,001 ± 0,001 ppm GPa-1 beziehungsweise -0,001 ± 0,003 ppm GPa-1. Die beiden Hβ-Resonanzfrequenzen von fünf Aminosäuren zeigen jeweils einen gegenläufigen Druckverlauf. Es sind dies Glutamat, Histidin, Leucin, Phenylalanin und Tyrosin. Die Extrema der linearen Druckabhängigkeit stellen Aspartat (0,083 ± 0,008 / 0,073 ± 0,007 ppm GPa-1) und eine der beiden stereospezifisch nicht zugeordneten Resonanzen von Glutamat (-0,190 ± 0,035 ppm GPa-1) dar. Die stärkste Nichtlinearität der Hβ-Druckantwort besitzt Leucin mit 0,57 ± 0,12 ppm GPa-2. Bei den weiteren Protonen der Seitenketten zeichnet sich Lysin (Hζ)3+ durch den betraglich größten Druckkoeffizienten erster Ordnung aus (-0,438 ± 0,034 ppm GPa-1), gefolgt von Glutamin Hε22 mit 0,410 ± 0,011 ppm GPa-1. Die größten Druckkoeffizienten zweiter Ord-nung sind bei Tryptophan Hε1 mit 0,63 ± 0,05 ppm GPa-2 und Glutamin Hε22 mit -0,28 ± 0,05 ppm GPa-2 zu finden. Die Resonanzfrequenzen von 15N verschieben sich mit steigendem Druck ausnahmslos in Richtung Tieffeld. Das cis-Isomer von Prolin weist mit 1,36 ± 0,02 ppm GPa-1 den kleinsten Druckkoeffizienten erster Ordnung der Rückgrat 15N chemischen Verschiebung auf, in trans-Konfiguration aber einen durchschnittlichen (2,45 ± 0,02 ppm GPa-1). Den größten Wert im Rückgrat besitzt Glycin mit 3,79 ± 0,08 ppm GPa-1, bei einem Mittelwert der druckinduzierten Änderung der chemischen Verschiebung in erster Näherung von 2,91 ppm GPa 1. Die stärkste Krümmung zeigt Tyrosin mit -4,52 ± 0,32 ppm GPa-2, die geringste wiederum das cis-Isomer von Prolin (-0,38 ± 0,10 ppm GPa-2). Die insgesamt größte druckinduzierte Änderung der chemischen Verschiebung aller 15N findet sich bei Nδ in Asparagin mit 7,65 ± 0,20 ppm GPa-1. Das generell am meisten nichtli-neare Druckverhalten besitzen die Resonanzen der Guanidinogruppe von Arginin mit 8,83 ± 0,91 ppm GPa-2 beziehungsweise -6,03 ± 0,88 ppm GPa-2. Sequenzabhängige Korrekturfaktoren veranschaulichen zudem druckinduzierte Einflüsse verschiedener Aminosäurereste auf ihre nähere Umgebung. Die Druckkoeffizienten erster Ordnung werden lediglich in ihrer Stärke, nicht in ihrem Vorzeichen beeinflusst. So erhöht Prolin die lineare Druckabhängigkeit des Amidprotons von Gly1 um 0,25 ppm GPa-1, Tyrosin und Valin dagegen reduzieren diese bei Gly2 um 0,13 ppm GPa-1. Der Druckkoeffizient zweiter Ordnung, ergo das Krümmungsverhalten, unterliegt durchaus einem sequenzabhängigen Vorzeichenwechsel, wie gezeigt werden konnte. Der starke Einfluss des Lösungsmittels auf die Rückgrat Amidgruppen verdeutlicht sich in der druckabhängigen 1JN-H-Kopplungskonstanten der indirekten Spin-Spin-Wechselwirkung. Dieser Zusammenhang konnte exemplarisch mittels MD-Simulation am Beispiel von Isoleucin verifiziert werden. Die Varianz der aminosäurespezifischen Kopplung von 3,4 Hz bei einem atmosphärischen Mittelwert von 94,5 Hz vergrößert sich auf 6,2 Hz bei 200 MPa mit einem nur leicht veränderten Mittelwert von -95,4 Hz. Somit hängt die Richtung der druckabhängigen Änderung der Kopplungskonstanten der Amidgruppen vom jeweiligen Aminosäurerest ab. Eine starke lineare Korrelation (0,61) der Größe der indirekten Spin-Spin-Wechselwirkung mit der Neigung einer Aminosäure, β-Stränge zu bilden, offenbart einen spezifi-schen Zusammenhang der Kopplungskonstanten mit Motiven der Sekundärstruktur. Die In-vivo-HP-NMR-Spektroskopie an Oozyten von X. laevis eröffnet einen nichtinvasiven Zugang zur Aufklärung der biochemischen Druckmodifikation der Zellmembran sowie des Zusammenhanges zwischen Mobilität und Signalvolumen bei Lipiden. Der strukturelle, lokale Charakter von Fettsäureketten bestimmt ganz wesentlich den Druckeinfluss auf die Mobilität. Der Anteil der Lipide, welche einen Phasenübergang hin zur gelartigen Immobilisierung durchlaufen, ist am geringsten für die Methingruppen der Doppelbindungen. Das Verhältnis des Kompartiments des Phasenübergangs zum druckunabhängigen Kompartiment beträgt hier lediglich 0,11 ± 0,01. Bei den Methylengruppen nahe am Glycerol-Rückgrat von Triacylglycerolen ist das Verhältnis beider Spezies mit 0,99 ± 0,04 ausbalanciert. Hier vollzieht die Hälfte der sichtbaren Signale einen Phasenübergang. Diesem Verhalten überlagert existiert eine kontinuierliche, geringe T2-Verbreiterung der Lipidsignale. Die strukturellen Unterschiede der Signalursprünge manifestieren sich darin ebenso. Mit 5 ± 2 ms pro 100 MPa verringert sich die transversale Relaxationszeit der Methingruppen am wenigsten. Dem gegenüber liegen die Methyl- sowie die sich häufig wiederholenden Methylengruppen gesättigter Bereiche mit je 25 ms pro 100 MPa. Durch die Analyse der rotatorischen Korrelationszeit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Steigerung der zytoplasmatischen Viskosität in Oozyten von X. laevis um 21 % zwischen 0,1 MPa und 200 MPa nachgewiesen werden