Klonale Diversität und phänotypische Heterogenität bei der Progression maligner Melanome

Der Nutzen systemischer Therapien beim malignen Melanom ist bis heute zumeist gering. Eine mögliche Ursache ist, dass die disseminierten Zielzellen dieser Therapien molekular schlecht charakterisiert sind. Der Nachweis gestreuter Tumorzellen (DCC) im Wächterlymphknoten stellt in der Diagnostik derzeit einen der wichtigsten prognostischen Faktoren dar. Bereits der immunhistochemische Nachweis einzelner Tumorzellen im Lymphknoten gilt als Kriterium für eine systemische Streuung des Primärtumors. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit, einzelne disseminierte Tumorzellen des Melanoms aus Wächterlymphknoten zu isolieren und molekular sowie funktionell zu untersuchen. Dazu wurde zunächst eine Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis vitaler DCC in Wächterlymphknoten über das membranständige Markermolekül Melanom-assoziiertes-Chondroitin-Sulfat Proteoglykan (MCSP) etabliert und ein Patientenkollektiv auf MCSP+ DCC in Lymphknoten untersucht. Es konnten morphologisch große und kleine MCSP+ Zellen isoliert werden. Bei Verwendung eines anderen Markers, dem Antigen gp100, für den aus der Arbeitsgruppe bereits erste molekulare Daten vorlagen, fand sich hingegen stets ein einheitlicher Phänotyp. Es wurden in dieser Arbeit MCSP+ und gp100+ DCC aus denselben Proben, sowie gp100+ DCC aus vorausgegangenen Studien miteinander verglichen. Die Sensitivität des MCSP-Nachweises wurde an Kontrolllymphknoten gesunder Spender überprüft. In den Kontrollen wurden ausschließlich kleine MCSP+ Zellen detektiert, die mediane Zellzahl und die Detektionsraten in den Kontrollen entsprachen denen der Patientenproben. Ein Ursprung MCSP+ Zellen aus dem Melanom wurde zunächst über eine PCR-basierte Expressionsanalyse melanozytärer Differenzierungsmarker und für das Melanom beschriebener Stammzell-assoziierter Marker überprüft. Die Marker gp100, MelanA und TRP2 wurden ausschließlich in den MCSP+ Zellen von Melanompatienten exprimiert und kennzeichnen 63 % der großen MCSP+ Zellen und 18 % der kleinen MCSP+ Zellen als maligne Zellen. Um weitere Aussagen zur Malignität der MCSP+ Zellen zu erhalten, wurde die DNA der isolierten Zellen auf Punktmutationen der Onkogene BRAF und NRAS, sowie durch komparative genomische Hybridisierung (CGH) auf charakteristische Veränderungen hin, untersucht und mit den Befunden der gp100+ DCC verglichen. Von den untersuchten Patienten teilten 38 % in ihren DCC Punktmutationen nicht zwischen MCSP+ und gp100+ Zellen. Ein Vergleich gepaarter Läsionen aus Primärtumor und Metastasen zeigte ebenfalls eine Heterogenität in 33 % der Patienten. Die CGH-Profile der DCC unterschieden sich zwischen den Zellpopulationen von MCSP und gp100, und zwischen großen und kleinen MCSP+ Zellen. Zellen von N1-Patienten beider Gruppen wiesen eine höhere Anzahl an Aberrationen auf, ebenso morphologisch große MCSP+ Zellen. MCSP+ Zellen trugen in 67 %, gp100+ Zellen in 82 % genomischen Veränderungen. Zudem konnten auch in 53 % der untersuchten kleinen MCSP+ Zellen Veränderungen nachgewiesen werden, was diese als maligne melanozytäre Zellen kennzeichnet. Die erfolgreiche in vivo Propagation von Tumoren nach subkutaner Injektion einzeln isolierter MCSP+ DCC in immundefizienten NSG-Mäusen, bestätigt deren tumorigenes Potential und ihre Bedeutung als Vorstufen manifestierter Lymphknotenmetastasen. Der Nachweis gp100+ Melanomzellen war sensitiver als die Routinepathologie und bestätigte frühere Studien der Arbeitsgruppe. Für MCSP+ DCC liegen derzeit finale Aussagen zur Malignität für mehr als 40 % der Zellen vor. Deshalb ist hier derzeit noch keine endgültige Aussage zur Nachweisrate von DCC mit MCSP möglich. Hinsichtlich klinischer Faktoren bestand ein signifikanter Zusammenhang lediglich zwischen einer Ulzeration des Primärtumors und dem Auftreten MCSP+ Zellen im Lymphknoten. Der Nachweis großer MCSP+ Zellen korrelierte negativ mit dem Überleben der Patienten, ebenso die klinischen Parameter histopathologischer Befund des Lymphknotens, Tumordicke und Mutationsstatus. Für die kleinen MCSP+ Zellen konnten keine Zusammenhänge zwischen dem Nachweis und dem Überleben der Patienten oder anderen klinischen Variablen gefunden werden. Hier muss allerdings die relativ kurze Beobachtungszeit der Patienten bis zum Abschluss dieser Arbeit berücksichtigt werden, die im Mittel unter 24 Monaten lag. Die gewonnenen Ergebnisse machen deutlich, dass die systemische Progression des malignen Melanoms über die Stufen der Erkrankung von der frühen Disseminierung in die Wächterlymphknoten bis zu manifestierten Metastasen einen dynamischen und heterogenen Verlauf zeigt. Diese Heterogenität muss verstärkt bei der Entwicklung neuer individualisierter Therapieansätze berücksichtigt werden. Großen MCSP+ DCC in Wächterlymphknoten kommt aufgrund ihrer Malignität, ihres tumorigenen Potentials und ihrem Einfluss auf das Überleben als Vorstufe der Metastasierung eine entscheidende Bedeutung zu. Kleine MCSP+ Zellen stellen nach den Ergebnissen dieser Arbeit möglicherweise eine im Prozess der Proliferation befindliche Vorstufe der großen Zelle dar. Die weitere molekulare und funktionelle Charakterisierung der DCC kann Hinweise auf potentielle therapeutische Zielstrukturen liefern. Diese Arbeit kann dazu als ein erster Schritt gesehen werden