Der Zellzyklusregulator Rca1 - Inhibitor und Substrat des Anaphase-Promoting-Komplexes in Drosophila melanogaster

Ein wichtiger Kontrollmechanismus des Zellzyklus ist die irreversible Proteolyse von Zellzyklus-Regulatoren. Dabei markieren E3-Ligasen Zielproteine durch Ubiquitinmoleküle. Für den Abbau in der Mitose und der G1-Phase reguliert der APC/C-Komplex (Anaphase-Promoting-Complex/Cyclosome) als E3-Ligase den zeitlichen Verlauf des Zellzyklus. Die Aktivität des APC/C wiederum wird in den übrigen Zellzyklusstadien durch Phosphorylierung und durch Proteine der Rca1/Emi1-Proteinfamilie inaktiv gehalten. Für eine vollständige APC/CFzr-Aktivität in der G1-Phase muss Rca1 seine inhibitorische Funktion auf den APC/CFzr verlieren. Es konnte gezeigt werden, dass Rca1 über einen anderen Mechanismus abgebaut wird als das Ortholog Emi1. Während Emi1 bereits in der Mitose SCFβTRCP-vermittelt abgebaut wird, ist bei Rca1 ein Abbau erst in der frühen G1-Phase zu erkennen. Für die Identifizierung der Abbausequenz wurden in dieser Arbeit live-cell-imaging und Durchflusszytometrie verwendet. Dazu wurden Schneiderzellen transient mit Fluoreszenz-markierten Rca1-Deletions-Derivate transfiziert und die Stabilität in G1 näher untersucht. Auf diese Weise wurden eine Abbausequenz im N-terminalen Bereich sowie eine im zentralen C-terminalen Bereich von Rca1 identifiziert. Letztere beinhaltet neben einer für Rca1 neu entdeckten Linkerregion eine KEN-Box-Domäne, die als bekannte Erkennungssequenz für APC/CFzr-Substrate gilt und somit eine direkte Verbindung zum APC/CFzr-Komplex herstellt. In verschiedenen Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Rca1-Abbau mit der Aktivierung des APC/CFzr zusammen fällt. In der G1-Phase beginnt der Abbau von Rca1 zeitgleich mit anderen APC/C-Substraten. Eine verfrühte Aktivierung des APC/CFzr durch die Überexpression von Fzr führt ebenfalls zu einem zeitgleich beginnenden Abbau in der Interphase. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Stabilität von Rca1 direkt von seiner Fähigkeit abhängt, den APC/CFzr zu inaktivieren. Während ein aktives Rca1 seinen eigenen Abbau verzögern kann, wird der Abbau eines inaktiven Rca1 durch die Überexpression von Fzr beschleunigt. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Rca1 während der S- und G2-Phase ein Inhibitor des APC/CFzr ist, jedoch im Verlauf der G1-Phase zu einem Substrat des APC/CFzr wird. Um einen endgültigen Nachweis zu erhalten, dass Rca1 sowohl Inhibitor als auch Substrat des APC/CFzr ist, wurde ein Drosophila-spezifischer, biochemischer in vitro-Ubiquitinylierungsassay etabliert. In diesem Assay konnte eine Ubiquitinylierung von APC/C-Substraten beobachtet werden und soll nun für die Analyse von Rca1 als Inhibitor des APC/C als auch als Substrat des APC/C eingesetzt werden