Datenbank-gestützte molekularbiologische Analyse melanomrelevanter Gene

Das maligne Melanom, das von den Melanozyten der Haut ausgeht, zählt zu den bösar-tigsten Tumorerkrankungen des Menschen. Aufgrund seiner Eigenschaft frühzeitig zu metastasieren, ist es durch eine oft schlechte Prognose und einen häufig letalen Verlauf gekennzeichnet. Häufige Ursachen für die Entartung der Melanozyten sind Mutationen oder Expressionsänderungen von Genen dieser Zellen. In den vergangenen Jahren wurden bereits große Fortschritte bei der Identifizierung von Genen, die zur Pathogenese des Melanoms beitragen, erzielt. Ziel dieser Arbeit war, anhand einer Onlinedatenbank weitere Gene zu finden, die aufgrund der veröffentlichten Daten auf eine Assoziation mit dem malignen Melanom hinweisen. Hierfür wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Studien der Internetdatenbank GEO Profiles des National Center for Biotechnology Information (NCBI) analysiert. Für 8000 Gene wurden bis zu sieben Affymetrix Arrays auf dieser Internetplattform des NCBI im Hinblick auf eine Korrelation mit dem malignen Melanom untersucht. Von den Genen, die anhand dieser Analyse als im Melanom reguliert gefunden wurden, wurden im Rahmen dieser Arbeit die Gene KCNN2 (potassium intermediate/small conductance calcium-activated channel, subfamily N, member 2), SHFM1 (split hand/foot malformation (ectrodactyly) type 1) und PLXNA1 (Plexin A1) für weitere Untersuchungen ausgewählt. Die untersuchten Arrayexperimente zeigten für alle drei Gene eine signifikant erhöhte Expression im Melanom im Vergleich zu normalen Melanozyten. Für alle drei Gene war bislang noch keine Regulation im Melanom bekannt. Anschließend wurde experimentell geprüft, ob der gefundene Zusammenhang für diese drei Gene bei der Melanompathogenese nachgewiesen oder widerlegt werden kann. Hierfür wurde die Expression der Gene in NHEMs (normale humane epidermale Mela-nozyten), primären Melanomzelllinien (Mel Ei, Mel Wei, Mel Juso, Mel Ho) und metastasierten Melanomzelllinien (Sk Mel 28, HTZ 19, Mel Im und Mel Ju) mittels quantitativer real-time PCR gemessen. Für KCNN2 und SHFM1 fanden sich jedoch in den experimentellen Untersuchungen keine signifikanten Unterschiede in der Expressionsstärke zwischen den normalen Melanozyten und den Primärtumor- bzw. Metastasenzelllinien. Bei PLXNA1 hingegen war die Expressionsstärke des Gens sowohl in den Primärtumor- als auch in den Meta-stasenzelllinien im Vergleich zu den nicht entarteten Melanozyten signifikant erniedrigt. Daher wurde die Expression dieses Gens anschließend in Gewebeproben gemessen. Auch hierbei wurden Proben aus normaler Haut mit denen aus primärem Tumorgewebe und Metastasen (Lunge, Lymphknoten, Haut) verglichen. Im Gegensatz zu den Expressionsmessungen in den Zelllinien fand sich hierbei eine signifikant erhöhte Expression in den Proben aus Primärtumor im Vergleich zu normaler Haut oder Metastasen. In den untersuchten Zelllinien konnte also für keines der drei Gene die aufgrund der Analyse der GEO Profiles-Datenbank erwartete Expression nachgewiesen werden. Mögliche Ursachen dieser differentiellen Expression werden im Rahmen dieser Arbeit diskutiert. Die experimentelle Untersuchung von Gewebeproben dagegen konnte die erhöhte Expression von PLXNA1 im Melanom bestätigen. Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit war, ob eine solche Datenbank grundsätzlich geeignet ist, Gene herauszufiltern, die eine Korrelation mit der Melanomentstehung oder -entwicklung aufweisen. Für zwei der drei näher untersuchten Gene muss dies prinzipiell verneint werden, da die molekularbiologische Untersuchung bei beiden Genen die durch die Internetanalyse vermutete höhere Expression im malignen Mela-nom nicht bestätigen konnte. Allerdings wurde bei diesen beiden Genen die Expression nur in Zelllinien gemessen. Bei dem dritten untersuchten Gen ließ sich die erwartete höhere Expression in Gewebeproben nachweisen. Die Gewebeproben spiegeln die tatsächlich vorhandene Genexpression in diesem Probenmaterial wider, während die Genexpression in den Zellkulturen unter anderem von dem Kulturmedium und den Anzuchtbedingungen abhängt und damit störanfällig sein kann. Daher muss in diesem Fall das Ergebnis in den Gewebeproben als ausschlaggebender als das aus den Zellli-nien erachtet werden. In diesem Fall weisen also sowohl die Expressionsmessung im Gewebe als auch die Analyse der Online-Datenbank eine verstärkte Expression von PLXNA1 im Melanom im Vergleich zu normalen Melanozyten auf. Dies zeigt, dass die verwendete Methode zumindest bedingt geeignet ist, um Gene zu identifizieren, die eine Korrelation mit dem Melanom aufweisen