Applicazione di un protocollo di immuno-stimolazione su individui di Pracambarus clarkii mirato alla produzione di peptidi con attività biologica

Uno dei principali problemi inerenti l’identificazione e l’analisi di nuovi peptidi naturali di origine marina è la disponibilità in termini quantitativi del materiale bioattivo (Cragg et al., 1997). Infatti, le concentrazioni di tali peptidi negli invertebrati marini sono spesso meno del 10-6 % del peso umido, ed il loro rendimento a seguito delle procedure di estrazione tradizionali risulta ancora più basso. Tuttavia, sono molteplici i fattori che possono influenzare l'esito della identificazione degli Anti Microbial Peptides (AMP), come le variazioni geografiche e stagionali (sito di campionamento), le diverse fasi della vita (specie pelagiche o bentoniche), l'età, il sesso e lo stato fisiologico (malattia, allevamento, muta). A causa della difficoltà nell’ottenere quantità sufficienti di composti bioattivi, potrebbe essere più produttivo dissezionare in diversi tessuti/organi gli invertebrati selezionati per poi estrarre il materiale da saggiare (Haug et al., 2002a, 2002b, 2004) ciò al fine di separare i peptidi di interesse da migliaia di sostanze inattive. Dividere gli organismi in parti differenti selezionando ciascun tessuto potrebbe anche fornire l'indicazione se l'animale produce da sé il principio attivo o se esso proviene dalla dieta o ancora è associato a parassiti o microrganismi. La maggior parte degli AMP marini sono stati di fatto isolati dal compartimento sangue, sia dall’emolinfa/fluido celomatico (sangue intero) o dagli emociti/celomociti (cellule del sangue). Alcuni peptidi tuttavia sono stati scoperti e isolati da altri tessuti, ma essendo questi circondati (negli invertebrati marini) dagli emociti/celomociti, è possibile che provengano da questi ultimi. Inoltre tutte le variabili analitiche hanno una potenziale influenza sul risultato sia in termini quantitativi che qualitativi oltre che per la stabilità del campione anche per la riproducibilità del protocollo. Tra queste variabili ricadono le condizioni di conservazione del campione (tempo trascorso dall’estrazione, la temperatura prima dell’estrazione ed alla separazione, il congelamento e la liofilizzazione), la tipologia del campione ed il metodo di prelievo, la separazione delle cellule dal sangue (velocità di centrifugazione, durata e temperatura), l’uso del tampone (tipo, pH, forza ionica e temperatura), l'uso e il tipo di anticoagulanti e cocktail inibitori della proteasi. Inoltre, dati bibliografici riportano come la stimolazione immunitaria determini un aumento sia quantitativamente che qualitativamente della produzione di peptidi antimicrobici. Per tale motivo si è proceduto ad effettuare un esperimento pilota per valutare se in tali condizioni fosse superiore la quantità di piccoli peptidi sintetizzati rispetto ad individui non stimolati e se nei differenti tempi di stimolazione selezionati, emergesse una differenziazione a carico dei peptidi prodotti in relazione ad una possibile attività di natura antibatterica