Etude de voies de communication - Application aux récepteurs nucléaires

Les Récepteurs Nucléaires (RNs) sont des facteurs de transcription ligand-dépendants contrôlant un grand nombre de processus biologiques au travers de la régulation de la transcription des gènes. Organisés en multidomaines, la plupart des RNs fonctionnent soit en homodimères soit en hétérodimères, le domaine de fixation du ligand (LBD) étant le contributeur majeur de la stabilité des différents dimères. Le sujet de ma thèse a consisté à établir les bases moléculaires de la discrimination entre ces deux états par deux approches complémentaires : la bioinformatique génomique et structurale couplée à des expériences de biologie moléculaire. L’approche bioinformatique a permis de scinder la super-famille des RNs en deux classes reliées au comportement oligomérique. Tous les homodimères appartiennent à la classe I, dans laquelle des résidus différentiellement conservés forment deux ponts salins connectant l’interface de dimérisation à la surface de fixation des cofacteurs tandis que les hétérodimères de classe II présentent d’autres résidus spécifiques connectant l’interface de dimérisation à la poche de fixation du ligand. Ces données nous ont permis de proposer l’existence de deux voies de communication connectant les surfaces actives des RNs par l’intermédiaire de deux jeux de ponts salins, véritables « motifs spatiaux » spécifiques des classes et différentiellement conservés de C. elegans jusqu’à l’homme. L’étude expérimentale des deux voies de communication s’est basée sur une série de mutations progressives des résidus spécifiques de classe, afin de transformer un RN de classe I (homodimère) en classe II (hétérodimère) et vice versa. Trois RNs tests ont été choisis pour leur comportement oligomérique différent (classe I : ERRγ et RXRα ; classe II : RARα) et l’impact des mutations a été examiné par quatre approches expérimentales analysant la stabilité et le type de dimérisation, la capacité de transactivation et la structure. Ces études ont montré que toute perturbation des voies impliquant l’interface de dimérisation entraîne des modifications du comportement oligomérique. Ce résultat suggère que le contrôle de l’état d’oligomérisation et le positionnement efficace de l’interface de dimérisation sont indissociables d’une voie de communication fonctionnelle et renforce l’importance de ces voies dans les phénomènes allostériques intégrant reconnaissance du ligand, du RN partenaire et des cofacteurs. De plus, nos résultats suggèrent l’implication directe des voies dans la coordination entre les surfaces impliquées dans ces reconnaissances et dans l’intégration des différents signaux cellulaires aboutissant à la transactivation. Par ailleurs, la résolution à 1.4 Å de la structure d’un mutant de ERRγ a fourni des pistes pour l’analyse, au niveau moléculaire, du lien entre voies et dimérisation, et pour la recherche d’un ligand fonctionnel de ce RN jusqu’alors considéré comme orphelin. Ainsi il semble que, pour intégrer en une seule protéine, les nombreux mécanismes de signalisation impliqués dans l’adaptation de la transcription aux variations des milieux internes et externes, les RNs ont développé des voies de communication inter- et intramoléculaires qui «connectent et informent» l’ensemble des surfaces actives et partenaires impliqués dans le système. Finalement, au regard des enseignements biologiques et méthodologiques obtenus, les RNs apparaissent comme un système modèle de choix pour aborder l’intégration des signaux cellulaires au sein de complexes macromoléculaires impliquant de multiples partenaires nucléiques, protéiques et moléculaires, une dynamique complexe d’édification, de modification et de dégradation et surtout, l’établissement d’une machinerie en accord avec les cycles cellulaires, hormonaux et de développement.Nuclear receptors (NRs) are ligand-dependent transcription factors that control a large number of physiological events through the regulation of gene transcription. Organized in several domains, NRs function either as homodimers or as heterodimers, where the ligand binding domain (LBD) plays the major role for the stability of the different dimers. The aim of my PhD consisted in establishing the molecular basis that discriminates the two states using two complementary approaches: genomic and structural bioinformatics combined with experimental data from molecular biology. Bioinformatic approaches have allowed us to partition the superfamily of NRs in two distinct classes based on their oligomeric behavior. All homodimers belong to class I, where differentially conserved residues form two salt bridges connecting the dimerization interface to the cofactor binding site, whereas class II heterodimers are characterized by other specific residues connecting the dimerization interface to the ligand binding pocket. Based on these data, we propose the existence of two communication pathways connecting active surfaces of NRs through two salt bridges representing “spatial motifs” specific for these classes and differentially conserved from C. elegans to human. The experimental approach used to study the two communication pathways was based on a progressive series of mutations of class specific amino acids, with the aim of transforming a class I NR (homodimer) to a class II NR (heterodimer) and vice versa. Three NRs were chosen based on their different oligomeric behavior (class I: ERRγ and RXRα; class II: RARα) and the impact of the mutations was studied by four experimental approaches to analyse the stability and type of dimerization, the transactivation capacity and the structure. These studies have shown that any perturbation of pathways involved in the dimerization interface caused modifications in the oligomeric behavior. This result suggests that controlling the oligomeric status and the correct positioning of the dimerization interface cannot be dissociated from a functional communication pathway and thus reinforces the importance of such pathways in allosteric phenomena in the context of ligand-, NR partner and cofactor recognition. Furthermore, our results suggest a direct implication of these pathways in the coordination between the surfaces concerned in such recognition and in the integration of different cellular signals leading to transactivation. Furthermore, resolving the structure of mutant ERRγ, at 1.4 Å, will allow us to study, at the molecular level, the link between communication pathways and dimerization, and to search for a functional ligand of this NR that has so far been considered an orphan receptor. Thus, it seems that, to integrate in a single protein entity, the numerous signaling mechanisms implicated in adaptation of transcription to the variations of internal and external environments, NRs have developed inter- and intramolecular communication pathways that interact and pass on information between the active surfaces and partners involved in the system. Taken together, NRs appear to be an ideal model to study the integration of cellular signals within macromolecular complexes, implicating binding of nucleic acids, proteins and other molecular partners, modification, degradation and the establishment of machinery inherently involved in cellular, hormonal and developmental cycles