Functional lateralization of spatial memory in the Rat: experimental approach by gene expression profiling and by reversible inactivation of the dorsal hippocampus in a spatial learning task

Le rôle de l’hippocampe dans la mémoire spatiale est bien établi. Des approches reposant sur des techniques de lésions ou d’inactivations réversibles, ou encore l’analyse de l’activité des cellules de lieu dans cette région du cerveau ont permis de montrer, chez des rats, que l’hippocampe dorsal constitue un module fonctionnel jouant un rôle essentiel dans la mémoire spatiale. La première partie de mon projet de thèse avait pour but de déterminer s’il existe, dans l’hippocampe dorsal du Rat, des gènes qui sont différentiellement exprimés lors de la réalisation d’une tâche de mémoire spatiale dans le test de la piscine de Morris. De manière inattendue, nous avons mis en évidence que cette tâche cognitive pourrait reposer sur un processus neurobiologique latéralisé, et plus particulièrement que l’hippocampe droit pourrait présenter une implication plus forte que celle de son homologue gauche dans cette fonction. En effet, nous avons observé que le nombre de gènes exprimés différentiellement (activés ou réprimés) au cours de la tâche est nettement plus important dans l’hippocampe droit que dans l’hippocampe gauche. Phénomène n’ayant pas encore été clairement mis en évidence chez le rongeur avant nos travaux, la latéralisation de l’hippocampe – notamment le rôle prépondérant de l’hippocampe droit dans la « gestion » des informations spatiales – est bien décrite chez l’Homme, et a fait l’objet d’un étayage expérimental plus récent chez l’oiseau (pigeon). C’est donc tout naturellement que, dans la deuxième partie de notre travail, nous avons essayé de montrer que le phénomène de latéralisation observé au niveau moléculaire (modification du transcriptome) reflétait une latéralisation fonctionnelle de l’hippocampe. Pour ce faire, nous avons réalisé le test de la piscine de Morris en inactivant unilatéralement (à droite ou à gauche) ou bilatéralement l’hippocampe de rats. L’hypothèse était qu’une inactivation à droite aurait des conséquences plus marquées sur les performances mnésiques qu’une inactivation à gauche. Les résultats, quoique mitigés, tendent tout de même à confirmer que l’hippocampe droit aurait le rôle le plus important dans la gestion des tâches spatiales chez le Rat. La première partie de notre travail a consisté à tester et valider une méthode permettant de préparer et d’analyser des microdissections de cerveau sur puces à ADN Affymetrix. Cette validation a été menée sur deux structures cérébrales de la Souris, à savoir l’hippocampe et le striatum. Une dissection manuelle classique ne nous permettant pas de prélever des échantillons avec le degré de finesse dont nous allions avoir besoin pour nos travaux chez le Rat, nous avons eu recours à la microdissection au laser. Cette méthode consiste à prélever, grâce à un laser couplé à un microscope, des échantillons de petite taille sur des coupes du tissu d’intérêt. Après optimisation de cette technique, nous avons procédé à la quantification d’ARN total présent dans les microdissections. Nos microdissections contenant environ 50 ng d’ARN total, il ne nous était pas possible d’utiliser un protocole classique de préparation d’échantillon permettant d’analyser le transcriptome sur puces à ADN, ce protocole nécessitant encore, à ce moment-là, au minimum 5 μg d’ARN total. Sur des dilutions d’un ARN total de référence et sur des microdissections d’hippocampe et de striatum de souris, nous avons donc testé et comparé deux protocoles d’amplification différents, tous deux disponibles dans le commerce. A partir d’ARN total, le processus classique consiste à synthétiser un ADNc par transcription inverse à partir de l’ARN total présent dans l’échantillon. Puis, un ARNc est synthétisé à partir de l’ADNc, par transcription in vitro, et cet ARNc sera ensuite hybridé sur une puce à ADN. La première technique d’amplification, ou amplification linéaire, consiste à répéter 2 fois de suite le protocole classique. Le deuxième protocole consiste à amplifier l’ADNc par PCR, grâce à des amorces spécifiques. Après préparation et hybridation sur puce à ADN de nos échantillons de souris, nous avons réalisé une étude statistique qui nous a permis de conclure que la méthode par PCR permettait d’amplifier l’échantillon de manière plus rapide, plus fiable, plus proportionnelle à la méthode classique, et avec un ARNc de meilleure qualité que par la méthode par double amplification. Néanmoins, les deux techniques ont débouché sur des résultats quasiment identiques, et surtout, nous ont permis de mettre en évidence, dans les deux cas, la présence d’ARNm spécifiques à l’hippocampe et au striatum. Nous avons finalement décidé de poursuivre notre étude en utilisant le protocole d’amplification par PCR. Dans un deuxième temps, après optimisation des protocoles, nous avons analysé le profil d’expression des gènes dans l’hippocampe de rats ayant réalisé le test de la piscine de Morris. Ce test permet d’évaluer les capacités du rat à gérer des informations spatiales dans une situation aversive. En effet, l’animal doit échapper à une situation inhabituelle et peu agréable (l’eau froide) en se réfugiant sur une plate-forme (PF) immergée sous la surface de l’eau. Les conditions de ce test peuvent être fixées de sorte qu’un rat ne puisse résoudre la tâche qu’en utilisant une stratégie d’orientation dans l’espace de type allocentrique, et donc basée sur son souvenir de la configuration de l’espace dans lequel il est testé. Les rats sont entraînés pendant 5 jours à raison de 5 essais consécutifs par jour. Le dernier jour, afin de vérifier si les rats ont bien appris la position de la PF immergée, le dernier essai est remplacé par un test de rétention pour lequel la PF est retirée de la piscine. Si le rat a bien appris la position de la PF, il nage principalement à proximité de l’endroit où se trouvait la PF lors des séances d’acquisition. Dans le cas contraire, il nage au hasard dans la piscine...The role of dorsal hippocampus in spatial memory is well established. Approaches relying on lesion or reversible inactivation techniques or on activity analysis of place cells in this region of the brain showed that in the rat, dorsal hippocampus plays a major role in spatial memory. The first part of this thesis project was to determine if there are genes in the rat dorsal hippocampus, genes that are differentially expressed in relation to a spatial memory task in the Morris water maze. Unexpectedly, we could show that this cognitive task could rely on a lateralized neurobiological process and more particularly that the right hippocampus could present a stronger implication than the left hippocampus in this function. In fact, we observed that the number of genes differentially expressed (activated or repressed) during this task was higher in the right hippocampus than in the left one. A phenomenon still not clearly demonstrated for the rodent before our work – and more particularly the major role of the right hippocampus in the “management” of spatial information – lateralization is well described in humans and has recently been supported by experiments in the pigeon. In the second part of our work, we tried to show that the lateralization phenomenon observed at a molecular level (modification of the transcriptome) was reflecting a functional lateralization of the hippocampus. For this, we performed the Morris water maze test with rats subjected to unilateral (right or left)or bilateral inactivation of hippocampus. Our hypothesis was that right inactivation would have more extensive effects on mnesic performances than left inactivation. Results, although slightly controversial, tend to confirm that the right hippocampus could have the most important role for the management of spatial information in the rat. The first part of our work consisted of testing and validating a method allowing preparation and analysis of brain microdissections on Affymetrix microarrays. This validation has been carried out on two cerebral structures of the mouse, namely the hippocampus and the striatum. Since classical manual dissection did not allow to dissect brain tissue as finely as necessary for our project in the rat, we employed laser capture microdissection. This method uses a laser coupled to a microscope to dissect out small-size samples of slices of the tissue of interest. After optimization of this technique, we quantified the amount of total RNA present in the microdissections. Given that our microdissections contained about 50 ng of total RNA, we were unable to use a classical sample preparation protocol to obtain sufficient cRNA to analyze the transcriptome on DNA microarrays, this protocol requiring, at that time, at least 5 μg of total RNA. Thus, using dilutions of a reference total RNA and microdissections of mouse hippocampus and striatum, we tested and compared two different amplification protocols commercially available. The classical protocol consists of synthesizing, by reverse transcription, a double stranded cDNA using the total RNA present in the sample as template. Then a cRNA is synthesized by in vitro transcription and this cRNA is hybridized to a microarray. The first amplification protocol, also known as linear amplification, consists of repeating the classical protocol twice. The second procedure consists of amplification of the cDNA through a PCR reaction, thanks to specific primers. After preparation and hybridization of our mouse samples to microarrays, we performed a statistical analysis that enabled us to conclude that the method involving PCR amplification allowed faster and more reliable sample preparation; moreover this method was also more proportional to the classical method and produced a cRNA of better quality than linear amplification. Nevertheless, the two techniques gave similar results, and above all, allowed us to show in both cases, the presence of specific mRNA expression in the hippocampus and the striatum. We finally decided to continue our study by using the protocol based on PCR amplification. In the second part of our project, we analyzed the gene expression profile of hippocampus of rats that were trained to the Morris water maze task. This test allows the evaluation of the rat’s capabilities to manage spatial information in an aversive situation. Actually, the animal has to escape from an unusual and unpleasant situation (cold water) by climbing onto a platform (PF) submerged right under the surface of the water. The conditions of this test can be adjusted so that the rat can only solve the task by using an allocentric orientation strategy, based on its memory of the configuration of the space where the test is performed. Rats were trained for 5 days and had 5 consecutive trials per day. The last trial of the last day was replaced by a retention test, in which the PF was removed from the water maze, in order to verify that rats really learned the position of the PF. When a rat has really learnt the PF position, it swims mainly nearby the place where the PF was positioned during training. In the opposite case, the rat would swim randomly in the water maze. In our study, we tested 40 rats, divided into 5 groups. A group of rats was trained to learn the position of the submerged PF and two groups were trained to find a visible PF (above the surface of the water) and tested with or without visible PF on the retention trial. Finally, we tested a group of rats that only swam for one minute in the water maze (without the PF) and a group of naive rats that had not been submitted to any behavioral test. After statistical analysis, we identified 623 differentially expressed genes in the right dorsal hippocampus of rats trained to remember the position of a hidden or visible PF, whereas only 74 genes had a modified expression profile in the left dorsal hippocampus of these rats. Among the 623 genes differentially expressed in the right hippocampus, 40% were linked to morphology, cell growth and cell reorganization and 25% to cellular signaling..