Coordination de l’assemblage du fuseau mitotique par des gradients d’interactions moléculaires générés par les chromosomes

Au cours du cycle cellulaire, les chromosomes sont distribués une seule fois et de façon identique entre les deux cellules filles. Ceci est effectué par le fuseau mitotique, une machine complexe composée de nanotubes de protéines, les microtubules. Ces tubes s’auto-organisent en une structure bipolaire au sein de laquelle les chromosomes se positionnent sur l’équateur et interagissent avec les microtubules au niveau de structures spécialisées, les kinétochores. Au début de la division cellulaire, les microtubules qui étaient alors longs et stables deviennent brusquement plus courts et dynamiques. Cela est dû à un changement général d’état du cytoplasme. Il a été observé qu’en l’absence de chromosomes, les microtubules ne pouvaient pas s’auto-organiser en un fuseau mitotique bipolaire au sein du cytoplasme mitotique. Cette observation surprenante a soulevé la question des mécanismes impliqués dans le processus d’auto-organisation du fuseau mitotique et en particulier du rôle possible des chromosomes. Ceci était intéressant dans la mesure où cela représenterait un exemple de coordination de l’assemblage d’une machine par l’objet même sur lequel elle agit. Il s’est avéré que les chromosomes jouent effectivement un rôle central dans leprocessus de formation du fuseau mitotique, en modifiant localement l’état du cytoplasme, ce qui induit la nucléation et la stabilisation des microtubules. Les microtubules s’auto-organisent alors en fuseau bipolaire, sous l’action de moteurs moléculaires. Les résultats présentés ici montrent théoriquement et expérimentalement que les chromosomes génèrent des gradients d’interactions moléculaires qui procurent une information spatiale nécessaire à la coordination de la nucléation et de la stabilisation des microtubules, deux événements essentiels dans le processus d’auto organisation du fuseau mitotique. Une petite molécule que l’on nomme Ran, existe sous deux formes. Un état riche en énergie qui contient du GTP et un état pauvre en énergie qui contient du GDP. Il y a un facteur sur les chromosomes qui échange le GDP de Ran pour du GTP et un autre facteur dans le cytoplasme qui active l’activité GTPasique de Ran. Ceci conduit à une haute concentration locale en Ran-GTP autour des chromosomes. Sous cette forme, Ran interagit avec des complexes moléculaires présents dans le cytoplasme. Ces complexes sont appelés importine-protéines nucléaires (protéines à NLS). Lors de la liaison du Ran-GTP aux importines, les protéines à NLS sont relâchées autour des chromosomes. Il se trouve que parmi ces protéines, il y a des molécules qui induisent la nucléation et la stabilisation des microtubules. Dans ma thèse, j’ai montré que de tels effets sont importants pour l’assemblage du fuseau mitotique. Ensuite, j’ai montré qu’il était possible de calculer la forme des gradients de Ran-GTP libre, de complexes Ran-GTP-importine et de protéines à NLS libres en utilisant des équations de réaction-diffusion. Finalement, j’ai visualisé le gradient formé par le complexe Ran-GTP-importine en utilisant la méthode de FLIM, et montré que ce gradient pouvait être lu de façon spécifique par le système microtubulaire de telle sorte qu’il induise la nucléation des microtubules près des chromosomes et leur stabilisation à plus grande distance. En résumé, j’ai montré que des phénomènes de réaction-diffusion autour des chromosomes sont à la base du contrôle de l’auto-organisation des microtubules en un fuseau bipolaire. Once in every cell cycle, living cells distribute evenly their chromosomes to the two daughter cells. The cellular machine that achieves chromosome segregation is the mitotic spindle, which is made of protein nanotubes arranged into a bipolar system that surround the chromosomes to which the tubes are attached through specialized regions, the kinetochores. At the onset of cell division, microtubules that were long and stable suddenly become shorter and highly dynamic. This is due to a general change in the state of the cytoplasmic environment. Surprisingly, the mitotic cytoplasm does not support the assembly of a bipolar spindle in the absence of chromosomes, raising questions about the mechanism of spindle assembly and the role of chromosomes in this process. This was interesting since this could represent an example of the coordination of the assembly of a machine by the substrate on which it is acting. It appeared that chromosomes actually play a central role in spindle assembly by modifying locally the nature of the cytoplasm in their vicinity, thereby promoting the nucleation and stabilization of microtubules that finally self-organize into a bipolar array thanks to the action of various molecular motors. In this thesis, I show both theoretically and experimentally that chromosomes generate gradients of molecular interactions that provide spatial cues required for the coordination of microtubule nucleation and plus end stabilization, two essential events in the pathway that leads to the self-organization of the mitotic spindle. A small molecule called Ran can be present in two forms. A high-energy state that contains GTP and a low-energy state that is loaded with GDP. On the chromosomes, there is a nucleotide exchange factor that loads Ran with GTP and in the cytoplasm there is a GTPase “activating factor” that forces Ran to hydrolyze the bound GTP into GDP. Previous work had shown that the local production of Ran-GTP around chromosomes leads to its interaction with molecular complexes present in the cytoplasm. These complexes are called importin-Nuclear proteins (NLS proteins). Upon binding of Ran-GTP to importins, NLS proteins are released around chromosomes. It turns out that among these NLS proteins, there are molecules that trigger microtubule nucleation and stabilize microtubules when they are released from importins. In my thesis, I have shown that such a local effect on microtubule nucleation and stabilization is important for the proper formation of a mitotic spindle. Then, I showed that reaction-diffusion equations allow calculating the shape and extent of the gradients of various molecular species like free Ran-GTP, Ran-GTP-importin complexes and free NLS proteins. Finally, I have used Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) technology to visualize the shape of the Ran-GTP-importin gradient and demonstrated that this gradient was read differently by the microtubule system so that microtubule nucleation occurs close to chromosomes while stabilization effects is sensed much further away. In summary, I have shown that a reaction-diffusion process occurring around chromosomes governs the self-organization of microtubules into a bipolar spindle