On the application and validation of multiplexed affinity assays

Proteins are essential macromolecules that carry out complex functions in human cells, tissues, and organs. They regulate a diverse set of biological processes and protect against pathogens. However, dysregulation or malformation of proteins can cause disease. By characterizing proteins in health and disease, we can gain insights into disease aetiology and identify druggable targets to treat disorders. By bringing protein discoveries from the research lab into clinical practice, protein assays have been and will continue to be important tools for enabling and improving medical decision-making. The work presented in this thesis concerns both exploratory and targeted affinity-based assays applied for the study of proteins. High-throughput and multiplexed suspension bead arrays have been the primary technology for measuring proteins with antibodies in samples such as human blood. Identification and validation of protein-protein interactions that may provide novel insights into the druggable proteome have also been carried out. Throughout the projects, methods for validating the observations have been pursued and include replication in independent sample sets, as well as the assessment of antibody selectivity via other proteomics assays or orthogonal methods such as genetic associations. In Paper I, we used multiplexed exploratory antibody arrays comprising almost 1.500 affinity binders to study proteins that circulate in plasma. Here, the focus was to determine the longitudinal variability of proteins. We analysed samples from 101 clinically healthy individuals, collected each third month for one year. The protein data provided insights into inter-individual diversity and the unique molecular fingerprint of each participant. We found that 49% of the studied proteins were stable across one year, as these had low variability in each individual. Eight modules, each containing 11-242 proteins, were found to co-vary across one year. We also found genetic variations to influence 15 of the detected protein profiles and confirmed selected indications in an independent set of 3.000 subjects. In summary, we observed the existence of individual-specific protein profiles and found that short-term and continuous changes occurred in almost every participant. In Paper II, we investigated blood-derived serum and plasma to identify age-associated proteins. We started from a large set of exploratory antibody bead arrays to screen 156 individuals aged 50-92 years. We found protein profiles of the histidine-rich glycoprotein (HRG) to be significantly associated with age. This association was further corroborated by the analysis of >4.000 individuals from eight additional and independent sets of blood samples. We further validated the HRG protein profiles by sandwich assays and protein microarrays developed in-house. Comparing genetic data and HRG profiles obtained by two independent antibodies, we observed strong but inverse associations to the genetic variants for two anti-HRG antibodies. In Paper III, we applied multiplexed assays for the detection of autoantibodies against cancer-testis antigens (CTAs) in 133 non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. We found reactivity against 29 unique CTAs exclusively in cases, compared to 57 matched controls with benign lung diseases. The presence of six CTAs was further confirmed in an independent set of 34 NSCLC cases. Analysis of longitudinal samples from seven patients demonstrated that the presence of CTA autoantibodies was stable over time for each of the individuals. In Paper IV, we developed a novel multiplexed sandwich-immunoassay for the detection of interaction partners to G-protein coupled receptors (GPCRs). This pharmaceutically important family of membrane proteins is believed to be regulated by another group of receptor activity-modulating proteins (RAMPs) by the formation of protein complexes. We studied cell lysates expressing combinations of 23 GPCRs with three RAMPs. We confirmed most of the previously reported interaction pairs and additionally found evidence for 15 new GPCR-RAMP complexes. All interactions were validated using epitope tags that were engineered onto the proteins. Selected complexes were further validated by in situ proximity ligation assays performed in cell membranes. In summary, the work included in this thesis describes the use of multiplexed affinity-based assays for research within plasma proteomics and the interrogation of protein complexes. The work highlights the method’s potential for the identification of circulating proteins that may aid and add to the current knowledge about human health and disease.Proteiner är makromolekyler som utför essentiella funktioner i människans celler, vävnader, och organ. De deltar i många olika biologiska processer och kan exempelvis skydda mot patogen, så som bakterier och virus. Proteiner är en av kroppens viktigaste byggstenar och förändringar i deras aktivitet kan leda till sjukdom. Genom att studera proteiner i friska och sjuka individer kan vi få en bättre inblick om de bakomliggande molekylära processer som orsakar sjukdom, samt identifiera målprotein för läkemedelsutveckling. Proteinanalys har varit och kommer att fortsätta vara ett viktigt verktyg inom sjukvården. Arbetet i denna avhandling berör affinitetsbaserade metoder för proteinanalys. Antikroppsarrayer med hög kapacitet att mäta många proteiner parallellt har tillämpats för att studera proteiner i blod. Dessutom har metoden använts för att identifiera och validera proteininteraktioner som kan vara relevanta för läkemedelsstrategier. Forskningsprojekten som presenteras här har ämnat att validera de undersökningarna som utförts genom att bland annat replikera resultaten i olika patientprov. Antikropparnas selektivitet har bekräftats genom jämförelser av olika proteinanalyser, antikroppsfria metoder, samt genetisk variation. I Paper I tillämpades en antikroppsarray bestående av 1.500 antikroppar för att studera proteiner som cirkulerar i blodplasma. Huvudsyftet var att undersöka hur proteinnivåer varierar över tid. Vi analyserade prov från 101 kliniskt friska individer som donerat blod var tredje månad under ett års tid. Proteindata visade att det fanns en inter-individuell mångfald och att varje individ har ett unikt proteinbaserat ”fingeravtryck”. Vidare fann vi att 49% av de studerade proteiner hade låg variabilitet inom varje individ och var stabila under året. Vi identifierade åtta grupper bestående av 11-242 proteiner som samordnat varierade under ett år. Femton proteiner var associerade till genetisk variation och ett urval av dessa bekräftades i en separat studie som inkluderade 3.000 personer. Sammanfattningsvis fann vi att varje individ har en personlig och unik proteinprofil som är mestadels stabil under ett år, samt att det förkommer både kortsiktiga och långsiktiga förändringar i proteinuttrycket hos varje individ. I Paper II analyserades proteiner som cirkulerar i blod och hur de är associerade till åldrande. Med hjälp av antikroppsarrayer undersöktes 156 individer i åldrarna 50-92 år och en association till åldrande identifierades för histidine-rich glycoprotein (HRG). Detta samband bekräftades även i en utökad analys av >4.000 blodprov från åtta separata kohorter. Vidare utvecklades en separat sandwich assay analysmetod för att utvärdera HRG-antikroppens affinitet. HRG-nivåer i blod som uppmättes med två olika antikroppar påvisade även stark association till en genetisk variant av HRG. I Paper III studerades förekomsten av autoantikroppar mot cancer testis antigens (CTAs) i 133 patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Vi identifierade reaktivitet mot 29 unika CTAs i patienter med NSCLC som ej påvisade reaktivitet i 57 prov från individer med godartade lungsjukdomar. Reaktiviteten för sex av dessa CTAs kunde bekräftas i ytterligare 34 NSCLC-patienter. Analys av longitudinella prover från sju patienter påvisade att uttrycket av CTA-autoantikroppar var stabilt under studieperioden för samtliga patienter. I Paper IV utvecklades en ny antikroppsbaserad analysmetod för detektion av proteiner som bildar komplex med G-proteinkopplade receptorer (GPCRs). Denna familj av membranprotein är viktig för många läkemedel. Det finns underlag för att GPCRs funktioner kan regleras via receptor activity-modulating proteins (RAMPs), en annan grupp av proteiner som kan bilda komplex med GPCRs. Med den nya analysmetoden studerade vi 23 stycken GPCRs i kombination med tre stycken RAMPs i cellysat. Vi kunde bekräfta majoriteten av tidigare rapporterade komplex, och kunde vidare identifiera ytterligare 15 helt nya GPCR-RAMP-komplex. Ett urval av interaktionerna validerades med hjälp av epitoptaggar på proteinerna, samt med hjälp av in situ proximity ligation assays. Sammanfattningsvis beskriver arbetet i denna avhandling användning av en affinitetsbaserad metod för proteinforskning i blodplasma, samt undersökning av proteininteraktioner. Studierna belyser metodens potential för identifikation av cirkulerande proteiner som kan komma att addera kunskap till det vi idag känner till om hälsa och sjukdom.QC 2020-09-04