A importância do papel da GPRASP2 na perturbação do espectro do autismo e défice intelectual

Thesis submitted to the Institute of Interdisciplinary Research of the University of Coimbra to apply for the degree of Doctor in Experimental Biology and Biomedicine, specialization in Neuroscience and DiseaseAutism spectrum disorder (ASD) is diagnosed based on the presence of persistent behavioral deficits affecting social communication, social interactions, and repetitive or restricted interests. ASD poses an immense burden to society, since in some countries it may afflict up to 1 in 68 children. Recent genetic and genomic studies have identified a multitude of mutations in proteins related to synapse formation, maturation, glutamate receptor activity and synaptic plasticity associated with ASD and intellectual disability (ID). In these neurodevelopmental disorders, neurons exhibit deficiencies in spine morphology and neuronal complexity which can correlate with the behavioral and intellectual deficits. Two complexes of particular importance to neuronal spines and synaptic processes have been of recent interest in the field. One is the trans-synaptic macromolecular assembly composed of the Neurexin/Neuroligin/PSD-95/SAPAP/SHANK/HOMER family of proteins. The other module includes proteins directly and indirectly linked to the mTOR signaling pathway and the regulation of cellular growth and protein synthesis, such as TSC1, TSC2, FMRP and PTEN. Together, these molecular complexes share as a common feature the regulation of mGluR signaling. Altered mGluR signaling has been strongly implicated in the pathophysiology of ASD and ID, however, research centering on the intracellular partners that directly regulate the trafficking and surface availability of these receptors has not been widely explored. In this context, the G Protein-Coupled Receptor Associated Sorting Proteins (GPRASPs) are an interesting target, as this family of proteins have been shown to regulate the trafficking of diverse GPCRs, such as the delta opioid, oxytocin, mGluR1 and mGluR5 receptors. In particular, GPRASP2 has been recently associated to autism and neurodevelopmental disorders in humans. However, the exact role of GPRASP2 in the nervous system and the consequences of its dysregulation remain unknown. To address some of these questions, we developed a novel conditional knockout mouse model. We demonstrate that mice lacking Gprasp2 expression display several phenotypes reminiscent of autism and ID, including abnormal social behavior, altered anxiety levels and enhanced mGluR-LTD. We show that GPRASP2 is expressed in several brain regions including hippocampus, thalamus, and hypothalamus which can be related to the behavioral deficits found in the knockout mice. Additionally, we found that changing the expression levels of GPRASP2 in vitro can bidirectionally affect dendritic spine morphology, neuronal complexity and interfere with mGluR5 trafficking in hippocampal neuronal cultures. Together, our data suggest that Gprasp2 mutations may contribute to the pathogenesis of neurodevelopmental disorders, affecting dendritic and spine morphology via disruption of mGluR5 trafficking. A perturbação do espectro do autismo (PEA) é diagnosticada com base na presença de défices comportamentais persistentes que afectam a comunicação social, as interações sociais e interesses repetitivos ou restritos. A PEA tem um imenso custo para a sociedade, sendo que em alguns países pode afectar cerca de 1 em cada 68 crianças. Estudos recentes na área de genética e genómica identificaram uma multiplicidade de mutações em proteínas relacionadas com a formação e maturação de sinapses, com a função do receptor do glutamato e com plasticidade sináptica, que estão associadas à PEA e ao défice intelectual (DI). Nestes distúrbios do neurodesenvolvimento, os neurónios apresentam anomalias na morfologia das espículas e complexidade neuronal, que se podem correlacionar com as alterações comportamentais e intelectuais. Dois complexos proteicos de particular relevância para a regulação de espículas e processos sinápticos têm sido o foco na investigação da PEA e DI. O primeiro é o complexo macromolecular trans-sináptico composto pela família de proteínas Neurexina/Neuroligina/PSD-95/SAPAP/SHANK/HOMER. O segundo módulo inclui proteínas direta ou indiretamente ligadas à via de sinalização mTOR e da regulação do crescimento celular e síntese proteica, como TSC1, TSC2, FMRP e PTEN. Juntos, estes complexos macromoleculares têm como uma característica comum a regulação da sinalização dos receptores metabotrópicos de glutamato (mGluR). A alteração da sinalização pelos mGluR tem sido fortemente implicada na fisiopatologia da PEA e DI, no entanto, investigação centrada nas proteínas que regulam diretamente o tráfico e a disponibilidade destes receptores à superfície da célula não está ainda amplamente explorada. Neste contexto, um alvo interessante é a família de proteínas GPRASP, visto que estas demonstraram regular o tráfico de diversos GPCRs, como por exemplo os receptores delta opióide, oxitocina, mGluR1 e mGluR5. Desta família, o gene GPRASP2 é particularmente interessante pois foi recentemente associada ao autismo e a distúrbios do desenvolvimento neurológico em humanos. Porém, o papel deste proteína no sistema nervoso e as consequências da sua desregulação são ainda desconhecidas. Para adereçar algumas destas questões, desenvolvemos um novo modelo de murganhos knockout (KO) condicional para o gene GPRASP2. Usando este modelo, conseguimos demonstrar que, na ausência de Gprasp2, os animais apresentam vários fenótipos característicos de PEA e DI, incluindo comportamento social anormal, alterações de ansiedade e aumento da depressão sináptica de longa duração associada aos mGluRs. Mostramos também que a GPRASP2 é expressa em várias regiões do cérebro, incluindo o hipocampo, o tálamo e o hipotálamo, regiões relevantes para os défices comportamentais encontrados nos murganhos knockout. Além disso, descobrimos que a alteração dos níveis de expressão de GPRASP2 in vitro pode afectar bidirecionalmente a morfologia das espículas dendríticas, assim como a complexidade neuronal por interferir com o tráfico de mGluR5. No seu conjunto, os nossos dados sugerem que mutações no gene GPRASP2, por via de uma desregulação de mGluR5, contribuem para a patogénese de distúrbios do desenvolvimento neurológico, afetando o comportamento animal, as propriedades sinápticas dos circuitos e a morfologia neuronal