Orquestrando a Diferenciação de Osteoclastos Através de ROS e da Regulação Mitocondrial: Desenvolvendo novas abordagens para o tratamento da osteoporose

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA remodelação óssea é um processo altamente regulado e dinâmico que envolve absorção de osso antigo pelos osteoclastos e formação de nova matriz óssea pelos osteoblastos. Com o envelhecimento, há uma multitude de mudanças que ocorrem no organismo alterando a sua função e metabolismo, e a remodelação óssea não é exceção. A osteoporose é uma doença que aparece como consequência de um aumento na absorção óssea que não pode ser superado pela formação de novo osso. Este desequilíbrio resulta numa diminuição da densidade óssea e um risco aumentado de fraturas no osso que são causa de grande incapacidade por parte da população afetada. Uma vez que o estrogénio é reconhecido como um regulador importante da remodelação óssea, mulheres após menopausa são um grupo particularmente suscetível ao aparecimento de osteoporose, uma vez que há uma diminuição nos níveis desta hormona. como consequência de uma diminuição na função dos ovários. As mitocôndrias, enquanto “powerhouse” da célula, são responsáveis por múltiplos papéis no organismo, sendo muito importantes para a diferenciação celular, uma vez que alteram o seu metabolismo como resposta às necessidades energéticas da célula. O objetivo principal deste estudo foi avaliar a performance mitocondrial dos macrófagos RAW 264.7 durante a diferenciação em osteoclastos mediada por RANKL na presença e ausência de E2. Para tal, diferenciámos macrófagos RAW 264.7 em osteoclastos após exposição a 50 ng/mL de RANKL, e avaliámos como é que o RANKL interfere com a sua performance mitocondrial e produção de ROS, tanto na presença como na ausência de estradiol. Os nossos resultados demonstraram que, após 6 dias de exposição a RANKL, as células obtidas expressavam Cathepsin K e TRAP, marcadores específicos de osteoclastos maduros e ativos. Adicionalmente, ao terceiro dia de exposição a RANKL, já existia um aumento dos níveis de proteína Cathepsin K, mostrando que o processo de diferenciação pode começar mais cedo do que foi sugerido inicialmente pela literatura existente. No entanto, a exposição a RANKL a longo-termo (desde 1 a 6 dias) diminuiu, nas células RAW 264.7, a taxa de consumo de oxigénio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR), dois parâmetros usados para avaliar o metabolismo celular, mostrando um perfil metabólico mais quiescente. Contudo, como esperado, foi observado um aumento na produção de Espécies Reativas de Oxigénio (ROS) celulares e mitocondriais, nas células RAW 264.7, após 6 dias de exposição a RANKL. O efeito agudo do RANKL no OCR e ECAR também foi avaliado. Aqui, os resultados obtidos demonstraram um aumento no OCR imediatamente após a adição de RANKL, mas nenhuma outra alteração, nem relativamente ao OCR nem ao ECAR, foram observadas após o tratamento agudo. Relativamente ao efeito do 17-β Estradiol, até ao momento, os resultados obtidos não nos permitem tirar uma conclusão firme e é necessária a realização de mais experiencias neste contexto. Contudo, os nossos resultados permitem-nos concluir que a exposição a RANKL a longo termo leva a uma diminuição no OCR e ECAR das células RAW 264.7, o que sugere uma diminuição do metabolismo celular durante a diferenciação em osteoclastos mediada por RANKL. Adicionalmente, a mitocôndria parece ter um papel relevante no processo e pode apresentar potencial enquanto alvo para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a osteoporose.Bone remodeling is a highly regulated and dynamic involving old bone resorption by osteoclasts and new bone matrix formation by osteoblasts. With aging, there are a multitude of changes that occur in the organism altering its functioning and metabolism, and bone turnover is not an exception. Osteoporosis is a disease that appears as a consequence of an increased bone resorption that cannot be overcome by bone formation. This unbalance results in a decreased bone density and increased risk of fractures that cause great disability in the affected population. Since estrogen is known to be an important regulator of bone turnover, postmenopausal women are particularly susceptible to osteoporosis appearance due to the decreased levels of this hormone, as a consequence of a declined ovarian function. Mitochondria, the cellular powerhouses, are responsible for a multitude of roles, being very important in cellular differentiation, shifting their metabolism to answer the cell energy requirements. The main goal of this study was to evaluate the mitochondrial performance RAW 264.7 macrophages during RANKL-mediated osteoclast differentiation in the presence and absence of E2. To achieve this goal, we differentiated RAW 264.7 macrophages into osteoclasts after exposure to 50 ng/mL of RANKL, and then evaluated how RANKL, both in the presence and absence of estradiol, interfered with mitochondrial performance and ROS production. Our results demonstrated that after 6 days of RANKL exposure, the obtained cells expressed Cathepsin K and TRAP, hallmarks of active and mature osteoclasts. In addition, at day 3 of RANKL exposure, Cathepsin K levels were already increased, showing that the differentiation process may begin earlier than it was first suggested by the literature. However, long term exposure to RANKL (for 1 to 6 days) decreased, in RAW 264.7 cells, the oxygen consumption rate (OCR) and the extracellular acidification rate (ECAR), two parameters used to assess the cellular energy metabolism, showing a more quiescent metabolic profile. However, as expected, an increase in cellular and mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS) was observed in RAW 264.7 cells after 6 days of exposure to RANKL. The acute effect of RANKL on OCR and ECAR of RAW 264.7 cells was also assessed. Obtained results demonstrated an increase in OCR immediately after addition of RANKL, but no other alteration in OCR and ECAR were observed after the acute treatment. Regarding the effect of 17-β Estradiol, at the moment, the obtained results do not allow to draw a solid conclusion and more experiments are needed in this context. However, our results allow us to conclude that long term exposure to RANKL leads to a decrease in OCR and ECAR in RAW 264.7 cells, which suggest a decrease in cellular energy metabolism during RAKL-induced osteoclast differentiation. Mitochondria appear to have a relevant role in the process, and may be potential targets for the development of new therapeutic strategies for osteoporosis