Xenografting of bovine ovarian tissue as a model for testing new drugs and examining angiogenesis, follicle premature depletion and dynamics

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaO processo de criopreservação de tecido ovárico é atualmente considerado como um dos futuros métodos de eleição na preservação da fertilidade feminina. O tecido ovárico removido e criopreservado, pode, depois, ser transplantado de modo a restaurar a função endócrina e a fertilidade. No entanto, a exequibilidade desta técnica apresenta ainda grandes desafios para a manutenção da viabilidade folicular durante o processo de vitrificação/aquecimento e após o transplante.Com a realização deste trabalho pretendeu-se consolidar os resultados preliminares obtidos pelo nosso grupo, em relação à aplicação in vitro de um produto comercial que possui na sua composição 40% de Mel de Grau Médico (L-Mesitran Soft) no incremento da densidade endotelial de tecido ovárico. Para tal foram usados fragmentos de córtex de ovários de bovino obtidos em matadouro, vitrificados, posteriormente desvitrificados, e colocados em meio de cultura durante 48 horas, suplementado com um dos seguintes produtos: L-Mesitran Soft, VEGF (fator de crescimento do endotélio vascular) ou Vitamina D, sendo de seguida avaliados antes ou depois do xenotransplante em ratos fêmea imunodeprimidos (homozigóticos Rowet nude) com 10 a 12 semanas de idade e previamente ovariectomizados. Um grupo controlo sem suplementação foi igualmente implementado. Os enxertos foram removidos às 48 horas (in vitro) ao 7º e 28º dia (in vivo) após transplante e submetidos a análises de imunohistoquímica [marcadores de densidade endotelial (Fator VIII), apoptose (Caspase 3), proliferação celular (Ki-67)], expressão génica (genes AMH, AMHR2, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, CYP11A1 e VASN) e de metilação do DNA (genes AMH e VASN).Os resultados obtidos, por meio de imunohistoquímica, demonstraram que o processo de vitrificação não afetou o tecido ovárico, bem como que a passagem pela cultura in vitro previamente ao xenotransplante melhora a recuperação do próprio tecido. Em termos de densidade endotelial, os tratamentos com L-Mesitran in vitro e in vivo apresentaram a maior capacidade de estimulação angiogénica (Fator VIII), de estimulação da proliferação celular (Ki-67) e apoptose celular (caspase 3), no âmbito de um processo normal de turnover celular. Foi também observada expressão génica dos genes CYP11A1 e AMHR2, no grupo L-Mesitran in vivo, após 28 dias de transplante.Finalmente, foi possível determinar pela primeira vez, uma região localizada numa ilha de dinucleótidos CpG do gene VASN, que apresentou uma correlação negativa forte com a expressão génica no córtex ovárico, em todos os grupos de estudo. No caso do gene AMH, foram também estudadas duas regiões genómicas, cuja ausência parcial de expressão foi associada a uma elevada percentagem de metilação. Foi assim possível verificar no modelo animal referido e através das diversas análises efetuadas, que a adição de L-Mesitran Soft, quer in vitro (meio de cultura) quer in vivo (no local de transplante), poderá constituir uma alternativa válida e menos dispendiosa, do que outros reagentes mais comumente utilizados para a eficácia da preservação de tecido ovárico.In the field of assisted reproductive technologies, the process of ovarian tissue vitrification is currently considered as one of the most promising methods to address female fertility preservation.Cryopreserved ovarian tissue can then be transplanted in order to restore endocrine function and fertility. However, the feasibility of this technique presents major challenges for the maintenance of follicular viability during the vitrification /warming process and after transplantation.The aim of this study was to consolidate preliminary results obtained by our group regarding the in vitro application of a commercial product containing 40% Medical Grade Honey (L-Mesitran Soft), in improving ovarian tissue endothelial density. For this purpose, ovarian cortical tissue, collected from slaughtered cows were vitrified, and then warmed and randomly assigned to in vitro cultured groups, supplemented with one of the following products: L-Mesitran Soft, VEGF (vascular endothelial growth factor) or Vitamin D, and then evaluated or xenotransplanted into immunodeficient (Rowet nude homozygous) ovariectomized rats with 10 to 12 weeks of age. A control group without supplementation was also constituted. These grafts were recovered after 48 hours (in vitro), 7 days and 28 days (in vivo) after transplantation and subjected to immunohistochemical [endothelial density (Factor VIII), apoptosis (Caspase 3), cell proliferation], gene expression (AMH, AMHR2, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, CYP11A1 and VASN genes) and DNA methylation level (AMH and VASN genes) analysis.Immunohistochemistry data showed that the vitrification process did not affect ovarian tissue and stressed the value of in vitro culture prior to transplantation.With respect to endothelial density, treatments with L-Mesitran in vitro and in vivo showed the highest angiogenic (Factor VIII) and cell proliferation (Ki-67) stimulation, alongside with cellular apoptosis (caspase 3), within a healthy cellular turnover pathway. Also, in the L-Mesitran in vivo group, the CYP11A1 and AMHR2 genes were expressed after 28 days of transplantation.Finally, it was possible to determine, for the first time, a region within a CpG rich genomic sequence of the VASN gene, which showed a strong negative correlation with ovarian cortex gene expression among all groups. In the case of the AMH gene, two genomic regions presented high methylation levels, that were correlated with low (or absent) expression levels.From the above data it was possible to conclude that the addition of L-Mesitran Soft, both in vitro and in vivo, should be considered as a potentially effective and less expensive strategy, which must be taken into account in relation to other more commonly used reagents, in ovarian tissue preservation efficiency.Outro - Este trabalho foi financiado pelos projetos UID/CVT/276/2019(CIISA) e ALT20-03-0246-FEDER-000021