Alergénios cutâneos: Moléculas com uma aplicação terapêutica improvável para a doença de Alzheimer

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaO efeito bem estabelecido dos compostos eletrofílicos na ativação do Nrf2 (do inglês nuclear fator (erythroid-derived 2)-like 2), concomitantemente com evidências experimentais que destacam o Nrf2 como um alvo molecular atrativo no contexto da doença de Alzheimer (DA) e também a recente aprovação pela FDA e EMA do fumarato de dimetilo (DMF) para o tratamento de formas recorrentes de Esclerose Múltipla, levaram-nos a hipotisar que o DMF, e outras moléculas eletrofílicas não exploradas até ao momento, poderão ter um papel preventivo e terapêutico na DA.A seleção dos alergénios cutâneos a serem investigados neste trabalho baseou-se em vários parâmetros, nomeadamente na sua capacidade de reagirem com os resíduos de cisteína e concomitantemente ativarem o fator de transcrição Nrf2, na hidrofobicidade das moléculas, nas propriedades de drug-likeness e ainda na previsão da toxicidade, com o objetivo final de obter um conjunto de compostos aptos a serem absorvidos no trato gastrointestinal, a atravessarem a barreira hematoencefálica e a exercerem toxicidade baixa /moderada. Além do DMF (utilizado como controlo positivo), foram ainda selecionados duas moléculas eletrofílicas drug-like e não exploradas no contexto da DA, a 1,4-fenilenodiamina (PPD) e o carbonato de metil-heptano (MHC) que, que tal como o DMF, são aceitadores Michael e reagem fortemente com resíduos de cisteína. O anidrido ftálico (PA), que reage preferencialmente com resíduos de lisina, foi usado como controlo negativo. O efeito deste painel de alergénios cutâneos em vários hallmarks da DA, nomeadamente na neuroinflamação, foi avaliado numa linha celular de ratinho da microglia (BV-2) exposta a LPS ou Aβ(1-42), e ainda no desequilíbrio redox neuronal, o qual foi investigado nas linhas células neuronais de ratinho (N2a), normal (N2a WT) ou com sobrexpressão de APP humana, normal (N2a-APPwt) e mutante (N2a-APPswe), sob condições basais ou após exposição ao oxidante H2O2. Concentrações não tóxicas de DMF, PA, PPD e MHC foram avaliadas pela técnica de Alamar Blue e por citometria de fluxo. Para testar a capacidade anti-inflamatória destes químicos, avaliou-se a produção de óxido nítrico (NO) com recurso ao reagente de Griess e ainda a expressão de proteínas pró-inflamatórios, nomeadamente a sintase indutível do óxido nítrico (iNOS), cicloxigenase (COX)-2, interleucina (IL)-1β e fator de necrose tumoral (TNF)-α, por Western blotting e reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). A expressão dos genes antioxidantes dependentes de Nrf2, nomeadamente Hmox1 e Nqo1, foi avaliada por RT-PCR. Os níveis proteicos de HMOX1 foram avaliados por microscopia confocal.Os alergénios cutâneos testados apresentaram um potencial anti-inflamatório, uma vez que diminuíram a produção de NO e a expressão da proteína iNOS. Além disso, o DMF e PPD também diminuíram a expressão das moléculas pró-inflamatórias iNOS e IL-1β, destacando o seu potencial para reverter condições de neuroinflamação. Curiosamente, as células N2a WT expressam níveis mais elevados de Hmox1 que as N2a-APPswe e os compostos DMF e MHC foram capazes de aumentar a expressão de Hmox1 em células N2a-APPswe. Além disso o PA e PPD reverteram os efeitos tóxicos desencadeados pelo H2O2 nas células N2a-APPwt.No geral, este trabalho destaca a potencial atividade anti-inflamatória e neuroprotetora dos alergénios cutâneos, investigada em modelos in vitro que mimetizam hallmarks da DA, e incentiva estudos adicionais que visam a validação dos resultados obtidos em modelos in vivo da DA.The well-established effect of electrophilic compounds on the activation of the nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2), concomitantly with experimental evidences highlighting Nrf2 as an attractive molecular target in the context of Alzheimer’s disease (AD) and also the recent approval by FDA and EMA of dimethyl fumarate (DMF) for the management of relapsing forms of multiple sclerosis, led us to the straightforward and innovative hypothesis that DMF and other unexplored electrophilic molecules, could have a preventive and therapeutic role in AD.The selection of the skin allergens to be investigated in this work was based on several parameters, namely their capacity to react towards cysteine residues and concomitantly to activate the transcription factor Nrf2, hydrophobicity, drug-likeness properties and toxicity prediction with the final goal of obtaining a set of chemicals able to be absorbed at the gastrointestinal tract, to cross the blood-brain barrier and to exert low to moderate toxicity. Besides DMF (as a positive control), we also selected two drug-like electrophiles unexplored in the context of AD, 1,4-phenylenediamine (PPD) and methyl heptine carbonate (MHC) that, similarly to DMF, are Michael acceptors and strongly react with cysteine residues. Phthalic anhydride (PA), which mainly reacts with lysine residues, was used as a negative control. The effect of this panel of skin allergens on AD hallmarks was investigated, namely on neuroinflammation, using the microglia mouse cell line BV-2 exposed to LPS or Aβ(1-42), and on neuronal impaired redox balance that was investigated in mouse neuronal cell line (N2a), normal (N2a WT) or human APP-overexpressing, normal (N2a-APPwt) and mutant (N2a-APPswe), under basal or stimulated with H2O2. A non-toxic concentration of DMF, PA, PPD and MHC was evaluated by Alamar Blue assay and flow cytometry. To test the anti-inflammatory capacity of these chemicals, nitric oxide (NO) production was measured through Griess reagent and the pro-inflammatory mediators, inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase (COX)-2, interleukin (IL)-1β and tumor necrosis factor (TNF)-α, were evaluated by Western blotting and by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). The expression of the antioxidant Nrf2-dependent genes, Hmox1 and Nqo1 were evaluated by RT-PCR. The protein levels of HMOX1 were assessed by confocal microscopy. The chemicals studied showed an anti-inflammatory potential by reducing NO levels and decreasing iNOS protein expression. Moreover, DMF and PPD also decreased the expression of the pro-inflammatory molecules, iNOS and IL-1β, highlighting their potential to rescue neuroinflammation. Interestingly, N2a WT express higher levels of Hmox1 than N2a-APPswe and DMF and MHC were able to increase Hmox1 expression in N2a-APPswe cells. PA and PPD reversed the toxic effects triggered by H2O2 on N2a-APPwt cells.Overall, this work highlights the potential anti-inflammatory and neuroprotective role of the selected skin allergens in in vitro models mimicking hallmarks of AD and supports further studies envisaging the validation of the results using vivo models of AD.Outro - This work was financed by the European Regional Development Fund (ERDF), through the Centro 2020 Regional Operational Programme under project CENTRO-01-0145-FEDER-000012 (HealthyAging2020) and through the COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalisation and Portuguese national funds via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, under project[s] POCI-01-0145-FEDER-029369 and UID/NEU/04539/2019. This work was funded by FEDER and FCT (project CENTRO-01-0145-FEDER-029369)