Estudios moleculares de la resistencia a insecticidas en triatominos

Según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS), la enfermedad de Chagas es una de las principales enfermedades desatendidas del subcontinente latinoamericano. El agente causante es el parásito protozoario Tripanosoma cruzi, transmitido a humanos por insectos triatominos de distintas especies. Debido a la ausencia de vacunas y tratamientos efectivos para la etapa crónica de la enfermedad, el control del vector sigue siendo el medio elegido para reducir el riesgo de transmisión. Después de casi 30 años de tratamiento con insecticidas piretroides, han emergido poblaciones de Triatoma infestans con altísimos niveles de resistencia, asociadas a fallas en las campañas de control, lo que plantea la necesidad de programas para el manejo de resistencia a nivel regional. Un requerimiento fundamental para ello es la detección temprana de la dispersión de poblaciones e individuos resistentes, así como del surgimiento de nuevos focos. Los piretroides ejercen su acción insecticida modificando el funcionamiento fisiológico de canales proteicos de Na+ dependientes de voltaje (NaV), presentes en la membrana de células excitables. Se conoce como kdr (knockdown resistance) a la reducción en la sensibilidad a piretroides causada por mutaciones puntuales en el gen NaV. El mecanismo de resistencia tipo kdr ha sido descrito en numerosas especies de insectos de interés económico y sanitario. La gran mayoría de las mutaciones correlacionadas con resistencia a piretroides se encuentra en el dominio II de esta proteína. El diseño de ensayos moleculares para detección de mutaciones asociadas a resistencia habilita la detección temprana de dispersión y surgimiento de nuevos focos, al permitir detectar la presencia de dichas mutaciones en insectos individuales, cuando la frecuencia poblacional de las mismas aún es baja. La detección temprana no puede conseguirse con ensayos de toxicidad, que detectan resistencia a nivel poblacional y no individual. En este sentido, en la primera parte de esta Tesis se realizó una evaluación de la sensibilidad y una optimización de los métodos moleculares de detección de mutaciones asociadas a resistencia, seguida de un estudio de la presencia de mutaciones para la región IIS4-IIS6 del gen del canal TiNav presentes en distintas poblaciones de T. infestans resistentes a piretroides provenientes de la ecoregión del Gran Chaco. Por otro lado, a través de una secuencia de TiNav detectada en una base de datos transcriptómica depositada en vector base (https://www.vectorbase.org/), complementada con el clonado y pirosecuenciación de regiones concretas del gen, se obtuvo la secuencia nucleotídica completa del mismo, y se realizó una caracterización bioinformática de la secuencia aminoacídica. Los resultados de esta parte del trabajo podrían tener aplicabilidad en el manejo de resistencia dentro de las campañas de control primario de Chagas. Durante el transcurso de la primera parte de la Tesis hemos encontrado que, aunque las mutaciones en el gen TiNav parecen ser la principal causa de resistencia a piretroides en T. infestans provenientes del Gran Chaco, no toda la resistencia es explicable por estos polimorfismos; distintas poblaciones con la misma frecuencia en una mutación kdr presentaron tasas de resistencia muy variables. Esto puede indicar que existen otros mecanismos de resistencia potencialmente involucrados en el fenómeno, tales como procesos de detoxificación y cambios en la penetrancia cuticular. En la segunda parte de esta Tesis, se realizó un estudio comparativo de la expresión diferentes enzimas detoxificativas entre una población sensible y una resistente de T. infestans provenientes del Gran Chaco. También se estudió la expresión génica en una población sensible expuesta a deltametrina, a fin de estudiar su posible papel en la respuesta detoxificativa a insecticidas piretroides, y posiblemente en la resistencia. Los experimentos mostraron una sobreexpresión de un citocromo P450 del clado 4 en la población resistente de T. infestans del Gran Chaco. No detectamos cambios en la expresión de las enzimas estudiadas cinco horas después de una topicación con deltametrina. Se estudió el rol de una Glutatión Transferasa del clado Delta (deltaGST) en la detoxificación de deltametrina. Se realizaron estudios bioinformáticos y de fisiología molecular usando como modelo Rhodnius prolixus. Se registró un aumento en la letalidad causada por dosis bajas de deltametrina cuando la expresión del gen de gst delta fue disminuida significativamente con técnicas de ARN de interferencia. La llamativa conservación en la estructura, función y farmacología del canal de sodio dependiente de voltaje a través del reino animal, genera que aquellos insecticidas que tengan como blanco esta molécula posean también una toxicidad potencial para otras especies. En este sentido, y teniendo en cuenta que las moléculas del sistema neuroendocrino (neuropéptidos y sus receptores) han sido propuestos como blanco de insecticidas, en el Capítulo 3 se estudió la expresión diferencial de genes precursores de diferentes neuropéptidos entre una población de T. infestans sensible a piretroides y otra resistente, a fin de obtener indicios de su posible papel en procesos asociados a resistencia. Por otra parte, se comparó el efecto de deltametrina en la inducción de la expresión de genes precursores de neuropéptidos en una población susceptible de T. infestans. En el Capítulo 4, a partir de secuencias ortólogas en Anopheles gambiae, Apis mellifera, Bombyx mori, Drosophila melanogaster y Tribolium castaneum, se identificaron genes de receptores de neuropéptidos en transcriptomas de T. infestans, Triatoma dimidiata y Triatoma pallidipennis generados en nuestro laboratorio, así como en el genoma de R. prolixus, por medio de búsquedas en bases de datos y análisis filogenéticos. Se espera que esta última parte del trabajo de Tesis aporte conocimientos para ampliar los horizontes en la investigación de posibles nuevos blancos de insecticidas, que sean capaces de reemplazar o complementar a los neurotóxicos dentro de estrategias de manejo integrado de plagas.Facultad de Ciencias Exacta