Development of an alternative method to detect the exogenous origin of testosterone and its metabolites via GC/C/IRMS

Die Einnahme von anabolen androgenen Steroiden ist im Sport generell nicht erlaubt, es würde dem Athleten einen verbotenen Vorteil gegenüber sauberen Konkurrenten verschaffen. Dennoch kommt es immer wieder zu Betrugsskandalen von Sportlern, die die Anti-Doping Regelungen des Internationalen Olympischen Komitees und der Welt Anti-Doping Agentur missachten. Die Detektion von solchen illegalen Substanzen stellt die entsprechenden Labors immer wieder vor sich ständig ändernde Herausforderungen. Besonders der Missbrauch von endogenen anabolen androgenen Steroiden, wie zum Beispiel Testosteron, ist schwer bestimmbar. Diese Stoffe werden auch körpereigen gebildet, daher muss zusätzlich die Herkunft bestimmt werden. Die einzige Möglichkeit exogen zugeführtes Testosteron vom endogenen eindeutig unterscheiden zu können, ist der Vergleich der Verhältnisse stabiler Kohlenstoffisotope von Testosteron und seinen Metaboliten, diese Analyse erfolgt mittels Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie. Ein Nachteil dieser Methode ist die Anfälligkeit auf Fehler durch Verunreinigungen. Im Urin, der verwendeten Probenmatrix für Dopingtests, liegen die Steroide als Konjugate vor, zusätzlich noch viele weitere Matrixsubstanzen. Daher muss die Probe vor einer endgültigen Analyse einer umfangreichen und gründlichen Probenvorbereitung unterzogen werden. Die derzeit im Anti-Doping Labor Seibersdorf angewandte Methode setzt die enzymatische Hydrolyse zur De-konjugation von Steroid-Glucuroniden ein. Anschließend werden die freien Steroide über eine präparative Hochleistungsflüssigchromatographie in einzelne Fraktionen aufgeteilt. Diese werden danach über Chromatographie gekoppelt mit Verbrennungs-Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie auf das Kohlenstoffisotopenverhältnis analysiert. Im Rahmen dieser Machbarkeitsstudie wurde eine alternative Methode für die Probenvorbereitung von Urinproben entwickelt. Dabei werden die Steroid-Konjugate zunächst über präparative Hochleistungsflüssigchromatographie aufgetrennt und ausgewählte Glucuronide in Fraktionen gesammelt. Anschließend erfolgt die Dekonjugation durch saure Hydrolyse der Glucuronide. Letztendlich wird das Kohlenstoffisotopenverhältnis der freien Steroide wie in der Routine mittels Isotopenverhältnis-Massenspektrometrie bestimmt. Die entwickelte Methode liefert Ergebnisse die vergleichbar sind mit jenen der Routine-Methode. Analyseergebnisse von positiven und negativen Qualitätskontrollproben erfüllen alle entsprechenden Kriterien der Welt Anti-Doping Agentur, daher ist die Methode prinzipiell für den Zweck geeignet.The use of anabolic androgenic steroids in sports is prohibited, as it would give the athlete an illicit advantage over clean competitors. Nonetheless, there are always frauds in professional sports who disregard the anti-doping rules set by the International Olympic Committee and the World Anti-Doping Agency. The detection of those illegal substances is a challenge for the analytical laboratories, that changes continuously. Especially the abuse of endogenous anabolic androgenic steroids like testosterone is difficult to determine. Since those substances are produced by the body on its own, their origin has to be confirmed. The only way to unambiguously distinguish between endogenously produced and exogenous administered testosterone is the comparison of the carbon isotope ratio of testosterone and its metabolites, determined by isotope ratio mass spectrometry. A downside of this method is its susceptibility to errors caused by impurities. As steroids are mainly excreted as conjugates combined with a complex urine matrix the sample preparation has to be extensive and thorough. The current method employed by the anti-doping laboratory in Seibersdorf relies on the enzymatic hydrolysis of steroid glucuronides followed by a chromatographic separation of the free steroids. The collected chromatographic fractions are then analysed by gas chromatography coupled to combustion isotope ratio mass spectrometry. During this proof-of-concept thesis an alternative method for the sample preparation was developed. The conjugated steroids are first separated by high performance liquid chromatography and fractions of selected glucuronides are collected. Afterwards, the glucuronides are deconjugated by acidic hydrolysis. Finally, the carbon isotope ratio is determined by isotope ratio mass spectrometry as in the established method. The developed method delivers results that are comparable to those of the routine analysis. Measurements of positive and negative control samples fulfill the criteria set by the world anti-doping agency, therefore the method is fit for purpose