Giftighet av biocider og blandinger av disse for algen Chlamydomonas reinhardtii

Aquatic organisms are exposed to several organic compounds including biocides. These compounds are widely used, for instance as disinfectants, in antifouling paints, or as material preservatives. Biocides can originate from different sources such as agricultural, urban and industrial runoff. Their presence in the aquatic environment is cause of concern, as they can be highly toxic, not only to target, but also to non-target organisms. Each type of biocide has specific effects according to its mode of action (MoA). Additionally, they may exist in complex mixtures and affect organisms through combined toxicity. This study intended to characterise the single and combined effects of five environmentally relevant biocides, aclonifen, bifenox, dichlofluanid, metribuzin and triclosan on the unicellular algae Chlamydomonas reinhardtii. Biocide toxicity was examined by analysing their effects in the freshwater microalgae through three different toxic endpoints: inhibition of growth, Photosystem II (PSII) efficiency and formation of Reactive Oxygen Species (ROS). The combined toxicity assessment was conducted using the concentration (CA) and independent action (IA) prediction models to analyse if the compounds in a mixture caused toxicity by similar or dissimilar MoA, respectively. For the compounds/mixtures which MoA and adverse outcomes were understood, preliminary Adverse Outcome Pathways (AOPs) were developed to collect, organize and evaluate all the relevant information. The results were also used to assess the potential environmental risk of the biocides to algae when present as single chemicals and in mixtures, by using a Risk Quotients (RQs) and Toxic Units (TUs) approach. The growth inhibition test allowed verifying the general toxicity of each biocide and of the mixture with all the compounds. The order of toxic potency was: bifenox> metribuzin> dichlofluanid> aclonifen> triclosan. The IA model best predicted the mixture involving all the biocides at 48 h and 72 h, thus suggesting that the compounds had different MoA. A potential antagonism was observed particularly at 24 h for low to median effect levels, possible due to the fact that the different compounds required longer time to propagate the effects to the apical level (growth). In this study, metribuzin, dichlofluanid, bifenox and triclosan showed a potential risk to algae, although the risk by dichlofluanid might be overestimated due to lack of adequate exposure information. The mixture with all the compounds presented a potential environmental risk for algae. From the 5 tested compounds (aclonifen, bifenox, dichlofluanid, metribuzin and triclosan), only aclonifen and metribuzin showed effects on the PSII efficiency, with the first being the most toxic. This effect was correlated with the inhibition of growth, showing that the inhibition of PSII was the main toxic MoA for these compounds. The effects of the binary mixture were best described by the IA model, consistent with these herbicides displaying additive effects by dissimilar MoA. For the growth, IA best fitted the data in the beginning of exposure, whereas the data was best predicted by CA at longer exposures. A concentration-dependent deviation from additivity, interpreted as synergy, was observed for medium to high concentrations of this mixture. While the single compounds did not present a risk at environmentally relevant concentrations, the effects of the binary mixture were higher than expected and a potential environmental risk was identified. The formation of ROS was a potential MoA for aclonifen and metribuzin; therefore, a high-throughput assay for ROS detection was used to analyse the 5 compounds (aclonifen, bifenox, dichlofluanid, metribuzin and triclosan). Among these, only aclonifen, metribuzin and bifenox induced ROS in a significant and concentrationdependent manner. The combined effects of the three herbicides were also studied in binary and ternary mixtures. The best predictions were achieved by the CA model when testing the ternary mixture and the binary mixture of aclonifen and bifenox at low to median effect levels, whereas synergism was observed at higher effects levels. The binary mixture of aclonifen and metribuzin was best predicted by the IA model, while the binary mixture of bifenox and metribuzin was equally well predicted by the two models. The combination of ROS formation and inhibition of photosynthesis was proposed to explain the observed combined effects. The present work demonstrated that C. reinhardtii is a suitable model organism to evaluate the toxicity of biocides and their mixtures. The applied methods were able to determine both sublethal and lethal effects of the studied compounds and provided a better understanding on their MoA. The CA and IA models provided good predictions for the observed effects of the mixtures of biocides with similar and dissimilar MoA. The cumulative risk assessment using TUs and RQs based approaches were shown to be an applicable way for predicting the risk of the biocides mixtures to algae. The present work has contributed to advance the field of ecotoxicology by providing a better understanding of the MoA of commonly used biocides, deciphering the combined toxicity of simple mixtures of these and identifying whether these biocides and their mixtures represent a risk to algae under ecological relevant exposure scenarios. Given the limited data available on the studied biocides, the knowledge gathered in the present work contributed to the characterization of their MoA and ecotoxicological effects in C. reinhardtii. This information can be integrated to further develop risk assessment tools for a better understanding and protection of the aquatic environment.Vannlevende organismer er utsatt for en rekke organiske forbindelser, inkludert biocider. Disse forbindelsene er mye brukt blant annet som desinfeksjonsmidler, i bunnstoff, eller som konserveringsmidler. Biocider kan stamme fra ulike kilder som landbruk, urban og industriell avrenning. Deres tilstedeværelse i det akvatiske miljøet er bekymringsverdig da de kan være svært giftige til målorganismer, men også arter de ikke er utviklet for å påvirke. Hver type biocid har spesifikke effekter i henhold til sin virkningsmekanisme (MoA). I tillegg eksisterer disse stoffene i komplekse blandinger og påvirke organismer gjennom kombinasjonsgiftighet. Dette studiet hadde til hensikt å karakterisere effekten av enkeltstoffer og blandinger av de fem miljørelevante biocidene aclonifen, bifenox, diklofluanid, metribuzin og triklosan på den encellede algen Chlamydomonas reinhardtii. Giftigheten av biocidene ble undersøkt ved å analysere deres effekter på ferskvannsalgen gjennom tre forskjellige giftighetsmekanismer: hemming av vekst, hemming av fotosystem II (PSII) effektivitet og dannelse av reaktive oksygenarter (ROS). Vurderingen av kombinasjonseffekter ble utført ved bruk av prediksjonsmodeller basert på konsentrasjonaddisjon (CA) og uavhengig samvirkeinteraksjon (IA) for å analysere om forbindelsene i en blanding skyldes effekten av samme eller ulik virkningsmekanisme. For forbindelsene/blandinger der MoA og skadeeffekter ble kartlagt, ble såkalte Adverse Outcome Pathways (AOP) utviklet for å samle, organisere og vurdere relevant informasjon. Resultatene ble også brukt til å vurdere den potensielle risikoen av biocidene på alger når tilstede som enkeltstoffer og i blandinger ved hjelp av beregning av risikokvotienter (RQ) og toksiske enheter (TU). Testen for veksthemming i alger verifiserte den generelle toksisitet av hvert biocid og blanding av disse. Giftighetspotensialet til de ulike stoffene var: bifenox> metribuzin> diklofluanid> aclonifen> triklosan. Modellen for uavhengig samvirkeinteraksjon predikerte effekten av alle biocidene ved 48 og 72 timer, og antydet at forbindelsene hadde ulike MoA. En potensiell antagonisme ble observert etter 24 timer eksponering for lave til intermediære effektnivåer, trolig på grunn av at forbindelsene hadde ulik evne til å gi effekter på organismenivå (vekst hemming). I dette studiet ble det påvist at metribuzin, diklofluanid, bifenox og triklosan hadde en potensiell risiko i forhold til alger, selv om risikoen av diklofluanid muligens var overestimert pga. mangel på tilstrekkelig eksponerings-informasjon. Blandingen med alle forbindelser viste seg å representere en potensiell miljørisiko for alger. Av de 5 testede forbindelsene (aclonifen, bifenox, diklofluanid, metribuzin og triklosan) var det bare aclonifen og metribuzin som ga effekter på PSII effektivitet, der aclonifen var den mest giftige. Denne effekten viste godt samsvar med veksthemming, som viser at inhiberingen av PSII var den viktigste MoA for disse forbindelsene. Virkningene av den binære blandingen ble best beskrevet av IA, noe som var i samsvar med at disse herbicidene ga additive effekter og hadde ulik MoA. For veksthemming ga IA best tilpasning til de eksperimentelle data i begynnelsen av eksponeringen, mens CA ga best tilpasning til effektdataene ved lengre eksponering. Et konsentrasjonsavhengig avvik fra additivitet, tolket som synergi, ble observert for middels til høye konsentrasjoner av denne blandingen. Mens de enkelte forbindelser ikke utgjorde en risiko for alger ved miljørelevante konsentrasjoner, var effekten av den binære blanding høyere enn forventet og representerte en potensiell miljørisiko for algene. Dannelsen av ROS er en potensiell MoA for aclonifen og metribuzin og medførte at et høy-kapasitetsassay for deteksjon av ROS ble brukt for å analysere effekten av de 5 forbindelsene (aclonifen, bifenox, diklofluanid, metribuzin og triklosan). Av disse biocidene var det bare aclonifen, bifenox og metribuzin som indusert ROS på en signifikant og konsentrasjonsavhengig måte. Samvirkeeffekten av de tre herbicidene ble også undersøkt i binære og ternære blandinger. De beste prediksjonene ble oppnådd ved bruk av CA modellen for den ternære (alle tre stoffene) og binære blandingen av aclonifen og bifenox med lav til intermediære effektnivåer, mens synergisme ble observert ved høyere effekternivåer. Den binære blanding av aclonifen og metribuzin ble beste predikert av IA-modellen, mens den binære blanding av bifenox og metribuzin var predikert like godt av de to modellene. Ble foreslått at en kombinasjon av ROS dannelse og inhibering av fotosyntesen kunne forklare de observerte blandingseffektene. Dette arbeidet viste at C. reinhardtii er en velegnet modellorganisme for å vurdere giftigheten av biocider og deres blandinger. De anvendte metodene var i stand til å bestemme både subletale og letale effekter av forbindelsene testet og ga en bedre forståelse av deres MoA. CA og IA-modellene ga gode prediksjoner av de observerte blendingseffektene med lik og ulik MoA. Den kumulative risikovurdering ved bruk av TUs og RQs baserte tilnærminger viste seg å være en relevant måte å forutsi miljørisikovurdering av biocidblandinger. Dette arbeidet har bidratt til å utvikle økotoksikologisk forskning ved å gi en bedre innsikt i MoA til vanlig anvendte biocider, avdekke sammenhengen om kombinasjonseffekter av enkle blandinger av disse, og identifisere hvorvidt disse biocidene og deres blandinger utgjør en risiko for alger under økologisk relevante eksponeringssituasjoner. Gitt den begrensede datatilgjengeligheten for disse biocidene har kunnskap samlet i dette arbeidet bidratt til karakterisere deres MoA og undersøke økotoksikologiske effekter i C. reinhardtii. Denne informasjonen kan samlet benyttes til å videreutvikle risikovurderingsverktøy og dermed bedre både kunnskapen om risiko og vern av organismer i det akvatiske miljøet