Influenza A(H1N1)pdm09 virus infection in swine : virus characterization and NK cell responses to infection

Influenza viruses balance on the interface between animals and humans, and swine represents a possible intermediate host for human viruses. It is therefore of great importance for animal welfare and to the public health to monitor the viral reservoir in swine. To better understand the mechanisms deciding clinical outcome, one also needs to study the host immune responses. Natural killer (NK) cells in general and the NKp46 receptor in particular, have been assigned a special role in influenza A virus infections. Little is known about NK cells during influenza A virus infections in swine. From the first detection of influenza A virus in Norwegian swine in 2009 until 2013, viral hemagglutinin (HA) genes were sequenced and compared to HA sequences from human viruses for the same period (paper 1). The formation of a distinct phylogenetic group was detected in late 2011, showing that the influenza A(H1N1)pdm09 virus (pH1N1) lineage had evolved in Norwegian swine, indicating that these viruses have established themselves in the Norwegian swine population. Two pH1N1 virus infection experiments were performed in swine. Lymphocytes were isolated from blood and lung and analyzed by flow cytometry and lung tissue sections were stained by immunofluorescence markers. Decreased numbers of NKp46+ NK cells were found in the blood of infected animals, while increased numbers were found in the lung (paper 2). Furthermore, flow cytometric analysis showed the same pattern for CD3+NKp46+ cells (paper 3), indicating a recruitment of cells expressing the NKp46 receptor to the lungs during pH1N1 virus infections in swine. Increased amounts of mRNA encoding tumor necrosis factor (TNF) were found in isolated lung lymphocytes by real-time RT-PCR (paper 2). To further study porcine NK cell responses to pH1N1 viruses, NKp46+ cells were isolated from blood and spleen and kept in proliferative cultures for 10 days. Subsequently, cells were stimulated with pH1N1 virus in vitro and analyzed by flow cytometry. Cultured NK cells degranulated and started the production of TNF upon exposure to the virus (paper 4). Taken together, these results indicate that NK cells migrate from blood into the lungs following pH1N1 virus infection, and that they participate in viral clearance by killing virus infected cells and by producing TNF.Influensa A virus er en viktig årsak til sykdom hos både mennesker og dyr, og gris kan fungere som en mellomvert for virus som kan smitte menneske. Overvåkning av virus reservoaret i gris er derfor viktig også for menneske. For å forstå hva som bestemmer det kliniske utfallet av influensa er det viktig å studere vertens immunrespons mot viruset. Naturlige drepeceller (NK celler) og aktiveringsreseptoren NKp46 har en antatt viktig rolle i influensa A virus infeksjoner. Allikevel er det lite som er kjent når det gjelder NK celle responser i gris ved en influensa A virus infeksjon. Fra influensa A viruset først ble oppdaget i norsk gris i 2009 og frem til 2013, ble HA genet sekvensert og sammenlignet med HA sekvenser fra humane virus fra samme tidsrom (artikkel 1). Virus fra slutten av 2011 dannet en distinkt fylogenetisk gruppe. Dette viser at det «pandemiske» influensa viruset, pH1N1, har utviklet seg i norsk gris, og tyder på at viruset også har etablert seg i den norske svinepopulasjonen. To infeksjonsforsøk med pH1N1 virus ble utført i gris. Lymfocytter ble isolert fra blod og lunge og analysert ved hjelp av flowcytometri. I tillegg ble lungesnitt analysert ved hjelp av immunofluoriserende markører. Det ble funnet en nedgang av NKp46+ NK celler i blod og en økning i lunge hos infiserte dyr (artikkel 2). CD3+NKp46+ celler viste det samme distribusjonsmønsteret (artikkel 3). Dette indikerer at celler som uttrykker NKp46 rekrutteres til lunge ved influensa A virus infeksjoner i gris. Ved hjelp av realtime RT-PCR ble det funnet økte nivåer av mRNA som koder for TNF i lymfocytter isolert fra lunge (artikkel 2). For å studere NK celle responsene i møte med influensa A virus mer inngående, ble NKp46+ celler isolert og holdt i prolifererende kulturer i 10 dager. Deretter ble cellene stimulert med influensa pH1N1 virus in vitro og analyserte ved hjelp av flowcytometri. NK cellene viste tegn på degranulasjon, samt produksjon av TNF som respons på influensaviruset (artikkel 4). Kort oppsummert indikerer disse resultatene at NK celler migrerer fra blod og til lunge som en følge av pH1N1 virus infeksjon i gris, og at de deltar i forsvaret mot viruset ved å drepe infiserte celler og produsere TNF.Norges Forskningsråd ; EU-kommisjone