Analysis of cell-cell junctions in MDCK cells

Die Zelllinie MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) wird oft für die Fragestellung betreffend Tight Junctions in Epithelzellen herangezogen. Tight Junctions zählen zu Zell-Zell Verbindungen und haben einerseits die Aufgabe eine apikale und basolaterale Seite in polarisierten Epithelzellen zu bewahren. Andererseits tragen sie dazu bei, benachbarte Zellen zusammenzuhalten und den parazellulären Fluss von Ionen und kleinen Molekülen zwischen jenen Zellen zu regulieren. Tight Junctions bestehen aus Transmembranproteinen (Occludin, Claudin, JAM) und cytoplasmatischem Plaque. Ziel dieser Arbeit ist es, optimale Bedingungen für Experimente herauszufinden um später die Abhängigkeit von dem Transmembran Protein Claudin-2 auf den Polaritätskomplex Par3/Par6/aPKC untersuchen zu können. In dieser Arbeit wurden also Vorversuche durchgeführt um die richtigen Bedingungen für ein Permeabilitäts-Assay mittels Fluoreszenz Messung, sowie die Auswirkung auf den Polaritätskomplex mittels Konfokalmikroskopie nach einem Knock-Down von Claudin-2 zu untersuchen. Für das Permeabilitäts-Assay wurde eine 40kDA-FITC-Dextran Lösung apikal zu einer Transwell Kammer hinzugefügt. In der Kammer wurden MDCK II Zellen auf einer semipermeablen Membran in verschiedenen Konzentrationen ausgesät. Nach verschieden langen Inkubationszeiten mit der Lösung wurde die Fluoreszenz der Lösung, welche in dieser Zeit den Zellrasen passierte, gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass Zellen in geringerer Konzentration (1 Mio Zellen/ml) eine höhere Permeabilität aufweisen als jene mit einer Konzentration von 1.5 Mio Zellen/ml, wobei beide Zellrasen 100% Konfluenz aufwiesen. Bei der Immunfluoreszenzfärbung von Par3 konnten sehr viele unspezifische Bindungen beobachtet werden, bis jetzt war es noch nicht möglich die richtigen Bedingungen für dieses Experiment herauszufinden.The MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) cell line is a cell type, commonly used to get a better understanding on Tight Junctions in epithelial cells. Tight Junctions are a type of cell-cell junctions which on the one hand maintain the apical and basolateral barrier in polarized epithelial cells. And on the other hand, seal neighboring cells together and regulate the paracellular flux of ions and small molecules. Tight Junctions are composed of transmembrane proteins (occludin, claudin, JAM) and cytoplasmic plaque. The aim of this work is to find out the best conditions for planned experiments for elaborating the dependence of the transmembrane protein claudin-2 and the polarity complex Par3/Par6/aPKC in MDCK II cells. Here, preliminary experiments were carried out to investigate the right conditions for a permeability assay through fluorescence measurement and observation of the impact on the polarity complex through confocal microscopy when knocking down claudin-2. For the permeability assay a 40kDA-FITC-Dextran solution was added apical to a transwell chamber with MDCK II cells seeded in different concentrations on a semipermeable membrane. After different times of incubation with the solution fluorescence basolateral of the cells was measured. It could be observed that, cells seeded in a lower concentration (1 Mio cells/ml) show higher permeability, than those seeded at 1.5 Mio cells/ml, whereas both showed a confluent monolayer. The preliminary immunofluorescence staining of Par3 showed a lot of unspecific binding and the optimal conditions could not be found yet