Verringerung der Quote : an unbeweglichen humanen Spermien durch Einführung einer optimierten Einfrierkurve für die manuelle Kryokonservierung

Die Kryokonservierung von Spermien in flüssigem Stickstoff, wird seit mehr als 50 Jahren angewandt. Dadurch kann sowohl Paaren mit unerfülltem Kinderwunsch geholfen werden, als auch die Fruchtbarkeit von Männern, welche sich einer Therapie zur Behandlung bösartiger Erkrankungen unterziehen, aufrecht erhalten werden. Nichtsdestotrotz führt die Kryokonservierung sowohl zu Veränderungen der Spermienstruktur, als auch zum Anstieg immobiler Spermatozooen. Für die physiologische Befruchtung der Eizelle, ist jedoch die Qualität und Anzahl gesunder, motiler Spermien ausschlaggebend. Heutzutage gibt es eine Vielzahl von Einfrierprotokollen, unter der Verwendung unterschiedlichster Einfriermedien und Anwendung empfohlener Einfriertechniken. Durch einen optimierten Einfrier- und Auftauprozess, kombiniert mit dem passenden Einfriermedium kann sowohl die intrazellulläre Eiskristallbildung gebremst, als auch eine höhere Überlebensrate der Zellen, erzielt werden. Für die Kryokonservierung der Spermien wird österreichweit die Methode des langsamen Einfrierens (Slow Freezing) angewandt. Dabei wird anhand kontrollierter Temperatursenkung und gleichzeitiger Equilibrierung der Zellen mittels Einfriermedium eine gleichmäßige Formierung von Eiskristallen bei -5°C bis -7°C, dem sogenannten Seeding Niveau (SN), erzielt. Anschließend erfolgt eine weitere Temperatursenkung in gleichmäßigen Schritten auf -40°C, der Homogeneous Nucleation Temperature (HNT), bevor die Spermien in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Das gängige und von diversen IVF-Anbietern beschriebene Protokoll des langsamen Einfrierens, sieht jedoch vor, die Samenproben oberhalb flüssigem Stickstoffdampf für 30min zu kühlen, bevor sie in flüssigem Stickstoff überführt werden. Die Herstellerangaben missachten dabei aber einige wissenschaftlich bewiesene Schritte, wie etwa das SN oder die HNT, die für das Überleben vieler Spermien essentiell sind. Für diese Bachelorarbeit wurde eine optimierte Einfrierkurve, unter Einführung der beiden Temperaturniveaus, entworfen um die beiden Einfriermethoden, die gängig angewandte und meine optimierte Einfrierkurve, miteinander zu vergleichen. Das Ziel der Studie war es die Sterberate, gemessen am relativen Anteil aller Spermien, sowohl innerhalb einer Einfriermethode, als auch zwischen der gängig angewandten Methode und meiner optimierten Einfrierkurve zu vergleichen. Die Ergebnisse der Studie konnten zeigen, dass die Werte innerhalb einer Einfriermethode konsistent sind. Basierend auf einer statistischen Auswertung mittels Wilcoxon-Vorzeichen Rang-Test konnte die Nullhypothese, wonach kein Unterschied zwischen den Methoden herrscht, nicht signifikant verworfen werden. Weitere Studien sind notwendig um die Auswirkungen äußerer Faktoren sowie den Verbleib von Extremen zu egalisieren. Aufgrund der COVID-19-Pandemie wurde diese Studie mit einem reduzierten Stichprobenumfang durchgeführt. Daher konnte weder auf etwaige Qualitätsunterschiede innerhalb der Stichprobe vorselektiert werden, noch konnten Extremwerte aus der Statistik exkludiert werden.Sperm Cryopreservation in liquid nitrogen has been used for more than 50 years. It supports couples with unfulfilled desire to have children, as well as maintaining male fertility before therapy of malignant diseases. Nevertheless, cryopreservation leads to changes of sperm structure and to an increased amount of immobile spermatozoa. However, the quality and amount of healthy motile sperm is crucial for the physiological fertilization of an egg cell. Nowadays, there is a variety of freezing protocols using cryoprotectants and recommended freezing techniques. By using optimized freeze-thawing rates and the appropriate cryoprotectant, limited intracellullar ice crystal formation and higher survival rates can be achieved. In Austria the method of slow freezing is used for the cryopreservation of sperm. It ist performed by simultaneously reducing the temperature while equilibrating the cells by adding cryoprotetctant causing uniform ice crystal formation at -5°C to -7°C, the so-called seeding niveau (SN). After that, temperature ist further decreased in a controlled manner to -40°C, called the homogeneous nucleation temperature (HNT), before sperms are stored into liquid nitrogen. The commonly described slow freezing protocol of various IVF providers, insists that semen samples have to be cooled above liquid nitrogen vapour for 30 min before preservation in liquid nitrogen. However, the manufacturer's instructions disregard some scientifically proven steps, such as the SN or HNT, which are essential for the survival of many sperm. For this bachelor thesis, an optimized freezing curve was developed by introducing the two temperature levels, hence allowing a comparison of the two freezing methods, the commonly used and my optimized freezing curve. The aim of the study was to compare the death rate, measured in terms of the relative proportion of all sperm, both within a freezing method and between the commonly used method and my optimized freezing curve. The results of the study showed that the values are consistent within a freezing method. Based on the statistical evaluation by Wilcoxon signed-ranks test, the null hypothesis saying that there is no difference between the methods could not be rejected significantly. Further studies are necessary to equalize the effects of external factors and the whereabouts of extreme values. Due to the COVID-19 pandemic, this study was performed with a reduced sample size. Hence, neither a preselection for any quality differences within the sample, nor the exclusion of extreme values from the statistics was possible