Detektion von tumorspezifischen Mutationen mittels quantitativer und digitaler PCR

Tumorspezifische Nukleinsäuren von Tumorzellen können als Biomarker für prognostische, diagnostische und prädiktive Zwecke in humanem Blut verwendet werden. Die Probleme bei der Detektion von tumorspezifischen Nukleinsäuren im Blut sind mögliche Tumorheterogenität und geringe Konzentrationen an Tumor-DNA vor einem großen Hintergrund an Wildtyp-DNA. Für die Detektion der tumorspezifischen Mutationen BRAF V600E, PTEN T167A und NRAS Q61L im Melanom wurden drei dPCR-Assays für Singleplex- und Multiplexanwendungen entworfen. Neben der Entwicklung der dPCR-Assays wurde ein Detektionslimit für die Mutation BRAF V600E in Vorversuchen mit DNA von Zelllinien ermittelt. Diese Studie zeigt die Funktionstüchtigkeit der Assays PTEN und BRAF mittels qPCR und das mit dPCR ermittelte Detektionslimit für BRAF V600E. Die hier präsentierte Methode ist in der Lage geringe Konzentrationen mutierter DNA vor einem Hintergrund von mindestens 4.000 Wildtyp-DNAs zu detektieren.Tumor-specific nucleic acids derived from tumor cells can be used as biomarkers for prognostic, diagnostic and predictive purposes in the blood of patients. The problems with the detection of tumor-specific nucleic acids in the blood are possible tumor heterogeneity and low concentrations of tumor DNA against a large background of wild-type DNA. For the detection of the tumor-specific mutations BRAF V600E, PTEN T167A and NRAS Q61L in melanoma, three dPCR assays for singleplex and multiplex applications were designed. In addition to the development of the dPCR assays, a detection limit for the BRAF V600E assay was determined in preliminary tests with DNA from cell lines. This study shows the functionality of the PTEN and BRAF assays using qPCR and the detection limit for BRAF V600E determined using dPCR. The method presented here is able to detect low concentrations of mutated DNA against a background of at least 4,000 wild-type DNAs