Identification of SCD1 as a heart failure-promoting gene by whole genome microarray gene expression profiling and transgenic techniques

With aging of the global society, cardiovascular diseases and heart failure are becoming leading causes of cardiovascular morbidity and mortality worldwide. The high morbidity and mortality of heart failure is partially attributed to insufficient treatment options and a lacking knowledge of pathomechanisms. The aim of this thesis was to identify pathomechanisms underlying the pathogenesis of heart failure in experimental models. The study used gene expression data of mouse models, which recapitulate major cardiovascular risk factors, chronic pressure overload and atherosclerosis. Chronic pressure overload was imposed by abdominal, aortic constriction (AAC), and as a model of atherosclerosis the study used apolipoprotein E-deficient (Apoe-/-) mice with hypercholesterolemia. Cardiac whole genome microarray gene expression data were analyzed of three different heart failure models of Apoe-/- mice, i.e. (I) aged, 18-month-old Apoe-/- mice, (II) young, 6-month-old Apoe-/- mice with AAC-induced chronic pressure overload, and (III) 8-month-old Apoe-/- mice with heart failure symptoms triggered by rosiglitazone, which is a heart failure-enhancing agonist of the adipogenic transcription factor, Pparg. The control groups were (I) age-matched, 18-month-old non-transgenic B6 mice, (II) 6-month-old Apoe-/- mice without AAC, and (III) 8-month-old Apoe-/- mice without rosiglitazone treatment. Gene ontology (GO) analyses of differentially expressed genes between failing hearts and respective control groups revealed the predominant up-regulation of genes from the cardiac lipid metabolic process in the three different heart failure models. The up-regulation of cardiac lipid genes was not only a characteristic feature of failing Apoe-/- hearts with hypercholesterolemia but was also triggered by AAC-induced chronic pressure overload of non-transgenic B6 mice. In search for potential heart failure-promoting genes, whole genome microarray gene expression data analysis identified Scd1, the stearoyl-coenzyme A desaturase 1, as one of the lipid metabolism genes with the highest, more than 10-fold up-regulation, in failing hearts. To investigate the role of cardiac SCD1 up-regulation in vivo, transgenic mice with myocardium-specific expression of SCD1 under control of the alpha-MHC promoter were generated. SCD1-transgenic mice were identified by genotyping PCR of ear-punch biopsies and used for further breeding. Two different transgenic Tg-SCD1 mouse lines were generated. Immunoblot analysis demonstrated the increased cardiac SCD1 protein level of SCD1-transgenic (Tg-SCD1) mice with 1.9±0.6-fold and 4.3±0.8-fold increased SCD1 protein levels compared to those of non-transgenic B6 controls. Phenotyping showed that 6-months-old Tg-SCD1 mice had developed cardiac hypertrophy with a significantly increased heart-to-body weight ratio. Concomitantly, echocardiography revealed a significantly decreased left ventricular cardiac ejection fraction of Tg-SCD1 mice (with high SCD1 protein level) of 35.2 ± 6.1 % compared to 52.7 ± 5.2 % of non-transgenic B6 controls (±s.d., n=6, p=0.0002). Histology analysis of hematoxylin-eosin-stained, paraffin-embedded cardiac sections further documented the cardiac hypertrophy of Tg-SCD1 hearts, and immunohistology confirmed the increased SCD1 protein contents of the hypertrophied Tg-SCD1 hearts. Whole genome gene expression profiling was performed to detect differentially expressed genes between Tg-SCD1 and non-transgenic B6 control mice. Data analysis showed that Tg-SCD1 hearts had significantly increased expression levels of heart failure-related genes, i.e. adiponectin (Adipoq), fatty acid synthase (Fasn) and resistin (Retn). In view of the heart failure phenotype induced by an increased cardiac SCD1 level, the next part of my thesis investigated pathomechanisms triggered by SCD1. A well-established pro-hypertrophic and failure-enhancing protein is the angiotensin II AT1 receptor, Agtr1. Radioligand binding studies with cardiac membranes and the radioligand, Sar1, [125I] Tyr4, Ile8-angiotensin II, detected a significantly increased number of AT1 receptor binding sites of Tg-SCD1 hearts compared to those of non-transgenic hearts, i.e. the number of AT1-specific binding sites was 1.6±0.2-fold higher of Tg-SCD1 hearts compared that of non-transgenic B6 mice. Autoradiography with anti-AT1 receptor antibodies confirmed the increased AT1 receptor protein level of Tg-SCD1 hearts and showed the predominant left ventricular localization of the up-regulated AT1 receptor on cryo-sections of Tg-SCD1 hearts with signs of heart failure. Next, the study investigated whether an increased SCD1 level was sufficient to mediate up-regulation of the AT1 receptor protein in isolated cells. To this end, HEK cells were transfected with an expression plasmid encoding the AT1 receptor without and with co-transfection of SCD1. Radioligand binding studies showed that SCD1 also increased the protein level of the AT1 receptor in HEK cells, i.e. the number of AT1 receptor binding sites was 2.2±0.4-fold higher of cells with AT1-receptor and SCD1-cotransfection compared to that of AT1-receptor-transfected cells. The direct effect of SCD1 on the AT1 receptor was further analyzed by fluorescence spectroscopy, which quantified the cellular AT1-Cerulean protein without and with co-transfection of SCD1. The expression of SCD1 significantly increased the cellular protein levels of the AT1-Cerulean protein, which was determined by fluorescence spectroscopy compared to the cellular fluorescence of HEK cells transfected with AT1-Cerulean only. Taken together, my thesis showed the predominant up-regulation of the cardiac lipid metabolic process in different heart failure models by whole genome microarray gene expression data analysis. Among different lipid metabolism genes, the impact of SCD1 up-regulation on heart function was investigated by generation of SCD1-transgenic mice. Moderately increased SCD1 levels (4.3-fold above the non-transgenic control) were sufficient to promote symptoms of heart failure such as cardiac hypertrophy and cardiac dysfunction. In addition, SCD1 triggered up-regulation of heart failure-related genes. And finally, SCD1 directly increased the protein level of the pro-hypertrophic and heart failure-enhancing angiotensin II AT1 receptor.Mit zunehmender Alterung der globalen Gesellschaft werden kardiovaskuläre Erkrankungen und Herzinsuffizienz zu Hauptursachen der kardiovaskulären Morbidität und Mortalität weltweit. Die hohe Morbidität und Mortalität von Herzinsuffizienz wird teilweise auf ungenügende Behandlungsmethoden und fehlende Kenntnis der zugrundeliegenden Pathomechanismen zurückgeführt. Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Identifizierung von Pathomechanismen, die der Pathogenese von Herzinsuffizienz in experimentellen Modellen zugrunde liegen. Die Studie verwendete Genexpressionsdaten von Mausmodellen, die wichtige kardiovaskuläre Risikofaktoren wie chronische Druckbelastung und Atherosklerose rekapitulieren. Chronische Druckbelastung wurde durch abdominale Aortenkonstriktion (AAC) ausgelöst, und als Modell der Atherosklerose benutzte die Studie Apolipoprotein E-defiziente (Apoe-/-) Mäuse mit Hypercholesterolämie. Es wurden kardiale Mikroarray-Genexpressionsdaten des Gesamtgenoms von drei verschiedenen Herzinsuffizienz-Modellen der Apoe-/- Mäuse analysiert: (i) gealterte, 18 Monate alte Apoe-/- Màuse, (ii) junge, 6 Monate alte Apoe-/- Mäuse mit AAC-induzierter chronischer Druckbelastung, und (iii) 8 Monate alte Apoe-/- Mäuse mit Symptomen von Herzinsuffizienz, die durch Rosiglitazon ausgelöst wurden. Rosiglitazon ist ein Agonist des adipogenen Transkriptionsfaktors, PPARG, der die Entwicklung von Herzinsuffizienz-Symptomen beschleunigt. Die Kontrollgruppen waren (i) 18 Monate alte, nicht-transgene B6 Mäuse, (ii) 6 Monate alte Apoe-/- Mäuse ohne AAC, und (iii) 8 Monate alte Apoe-/- Mäuse ohne Rosiglitazon-Behandlung. Die Analyse der Genontologie (GO) von Genen mit differentieller Expression zwischen den insuffizienten Herzen und den zugehörigen Kontrollen zeigte die prädominierende Hochregulation von Genen des kardialen lipidmetabolischen Prozesses in den drei verschiedenen Herzinsuffizienz-Modellen. Die Hochregulation der kardialen lipidmetabolischen Gene war nicht nur ein charakteristisches Merkmal von insuffizienten Apoe-defizienten Herzen mit Hypercholesterolämie, sondern wurde auch durch AAC-induzierte chronische Druckbelastung in nicht transgenen B6 Mäusen ausgelöst. Auf der Suche nach potentiellen Herzinsuffizienz-fördernden Genen identifizierte die Analyse der Gesamtgenom-Mikroarray-Genexpressionsdaten Scd1, die Stearoyl-Coenzym A Desaturase 1, als eines der Gene des Lipidmetabolismus mit der höchsten, mehr als 10-fachen Hochregulation in den Herzen mit Herzinsuffizienz. Um die Rolle der Hochregulation der kardialen SCD1 in vivo zu untersuchen, wurden transgene Mäuse mit Myokardium-spezifischer Expression von SCD1 unter Kontrolle des alpha-MHC-Promoters generiert. SCD1-transgene Mäuse wurden durch Genotypisierung mittels PCR-Analyse von Biopsie-Gewebe aus dem Ohrläppchen identifiziert und für die weitere Zucht eingesetzt. Es wurden zwei verschiedene SCD1-transgene Mauslinien generiert. Eine Immunoblot-Analyse zeigte den erhöhten kardialen Gehalt an SCD1-Protein von SCD1-transgenen (Tg-SCD1) Mäusen mit 1.9±0.6-fach und 4.3±0.8-fach erhöhten SCD1-Proteingehalt im Vergleich zu nicht-transgenen B6 Kontrollen. Die Phänotypisierung zeigte, dass 6 Monate alte, SCD1-transgene Mäuse eine kardiale Hypertrophie mit einem signifikant erhöhten Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht entwickelt hatten. Gleichzeitig zeigte die Echokardiographie eine signifikant verminderte linksventrikuläre kardiale Ejektionsfraktion der SCD1-transgenen Mäuse mit hohem SCD1 Proteingehalt von 35.2 ± 6.1 % im Vergleich zu 52.7 ± 5.2 % bei nicht-transgenen B6 Kontrollen (±s.d., n=6, p=0.0002). Darüber hinaus dokumentierte die histologische Analyse von Paraffinschnitten, die mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt waren, die kardiale Hypertrophie von SCD1-transgenen Herzen, und der immunhistologische Nachweis von SCD1 bestätigte die erhöhten SCD1-Proteinmenge der hypertrophen, SCD1-transgenen Herzen. Um unterschiedlich exprimierte Gene zwischen SCD1-transgenen und nicht-transgenen B6 Kontrollmäusen zu identifizieren, wurde eine Genexpressionsstudie des gesamten Genoms durchgeführt. Die Datenanalyse zeigte, dass SCD1-transgene Herzen eine signifikant erhöhte Expression von Genen zeigten, die mit Herzinsuffizienz assoziiert sind, wie z. B. Adiponectin (Adipoq), Fettsäure-Synthase (Fasn) und Resistin (Retn). Angesichts des Phänotyps der Herzinsuffizienz, der sich infolge eines erhöhten kardialen SCD1-Spiegels entwickelte, untersuchte der nächste Teil der Doktorarbeit Pathomechanismen, die durch SCD1 ausgelöst werden. Der Angiotensin II AT1 Rezeptor, Agtr1, ist ein gut etabliertes, Hypertrophie-stimulierendes und Herzinsuffizienz-verstärkendes Protein. Durch Bindungsstudien mit dem Radioliganden Sar1, [125I] Tyr4, Ile8-Angiotensin II wurde an kardialen Membranen eine signifikant erhöhte Anzahl an AT1-Rezeptor-Bindungstellen bei SCD1-transgenen Herzen im Vergleich zu nicht transgenen Herzen detektiert, d.h. die Anzahl an AT1-spezifischen Bindungsstellen war bei SCD1-transgenen Herzen 1.6±0.2-fach höher als bei nicht transgenen Herzen, die aus B6 Mäusen isoliert worden waren. Die autoradiographische Analyse mit AT1 Rezeptor-spezifischen Antikörpern bestätigte die erhöhte AT1 Rezeptorproteinmenge von SCD1-transgenen Herzen und zeigte die überwiegend linksventrikuläre Lokalisierung des hochregulierten AT1 Rezeptors auf Gefrierschnitten von SCD1-transgenen Herzen mit Symptomen von Herzinsuffizienz. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob ein erhöhter SCD1-Spiegel ausreicht, eine Hochregulation des AT1 Rezeptorproteins in isolierten Zellen zu bewirken. Um diese Frage zu untersuchen, wurden HEK Zellen mit einem Expressionsplasmid transfiziert, das für den AT1 Rezeptor kodiert. Zusätzlich wurden die Zellen entweder mit einem SCD1-kodierenden Expressionsplasmid oder einem Kontrollplasmid transfiziert. Radioligandenbindungsstudien zeigten, dass eine Zunahme von SCD1 auch die Menge des AT1 Rezeptorproteins in HEK Zellen erhöhte. Die Anzahl an AT1 Rezeptor-Bindungsstellen nach SCD1 Kotransfektion war 2.2±0.4-fach höher als bei Zellen, die den AT1 Rezeptor ohne zusätzliche SCD1-Expression exprimierten. Der direkte Effekt von SCD1 auf den AT1 Rezeptor wurde außerdem mit Fluoreszenz-Spektroskopie analysiert, die das zelluläre AT1-Cerulean-Protein mit oder ohne SCD1 Kotransfektion quantifizierte. Die Expression von SCD1 erhöhte signifikant den zellulären Proteinspiegel des AT1-Cerulean-Proteins, das mittels Fluoreszenzspektroskopie im Vergleich zur zellulären Fluoreszenz von HEK Zellen bestimmt wurde, die nur mit AT1-Cerulean transfiziert worden waren. Zusammenfassend zeigt diese Doktorarbeit durch eine Analyse von Mikroarraygenexpressions-Daten des gesamten Genoms die prädominierende Hochregulation des kardialen lipidmetabolischen Prozesses in verschiedenen Modellen der Herzinsuffizienz. Unter den verschiedenen Genen des Fettstoffwechsels wurde SCD1 ausgewählt und der Einfluss der Hochregulation von SCD1 auf die Herzfunktion durch Generierung von SCD1-transgenen Mäusen untersucht. Ein moderat erhöhter SCD1-Spiegel (4.3-fach höher als die nicht transgene Kontrolle) war ausreichend, um Symptome der Herzinsuffizienz, wie z. B. kardiale Hypertrophie und kardiale Dysfunktion, auszulösen. Zusätzlich bewirkte SCD1 die Hochregulation von Herzinsuffizienz-assoziierten Genen. Und schließlich erhöhte SCD1 direkt den Proteinspiegel des Hypertrophie-stimulierenden und Herzinsuffizienz-verstärkenden Angiotensin II AT1 Rezeptors