Essai de purification de l'ATP diphosphohydrolase du pancréas et production d'anticorps polyclonaux

Ce travail se voulant une suite des travaux précédents portant sur l'ATP liphosphohydrolase du pancréas de porc, l'hypothèse posée était directement liée aux résultats obtenus antérieurement. Celle-ci s'énonçait comme suit: La composante protéique de 58 kDa, identifiée suite à la purification de l'enzyme, constitue la sous-unité responsable de la liaison du substrat par l'ATPDase. Les objectifs à réaliser afin de démontrer cette hypothèse étaient les suivants: 1) identifier la sous-unité recherchée par un marquage au FSBA et des compétitions entre le FSBA et les nucléotides substrats de l'enzyme, b) purifier cette protéine, en faire déterminer en partie la séquence en acides aminés, et c) produire des Ac polyclonaux contre celle-ci. Le marquage au PSBA et les compétitions n'ont pas permis d'identifier une protéine unique comme étant l'unité responsable de la liaison du substrat. En fait, trois protéines de 92-97, 66 et 46-50 kDa ont été identifiées comme étant potentiellement la protéine recherchée. Les protéines marquées par le FSBA ont été purifiées en utilisant des Ac dirigés spécifiquement contre le FSBA et des billes d'agarose-Protéine A. De façon à discriminer entre les trois protéines, chacune d'elle a été injectée afin de produire des Ac polyclonaux. L'hypothèse sous-jacente était que s'il y avait inhibition de l'activité ATPDase par les Ac, ceux-ci seraient dirigés contre la sous-unité responsable de la liaison du substrat. L'Ac inhibiteur permettrait alors de savoir laquelle des trois protéines correspond à l'ATPDase. Deux Ac dirigés contre les protéines de 66 et 46-50 kDa on été produits. Des tests de caractérisation des Ac ont montré que ceux-ci n'avaient aucun effet inhibiteur sur l'activité enzymatique. Ils ne présentaient pas non plus de réactivité contre le contenu protéique de la ,ande d'activité d'hydrolyse de l'ATP et de l'ADP. De plus, aucun des deux Ac ne s'est avéré apte à immunoprécipiter l'enzyme. L'ensemble des résultats nous permet de conclure que les Ac produits ne sont pas dirigés contre l'ATPDase mais plutôt contre d'autres protéines de la membrane du grain de zymogène. Le FSBA s'est donc avéré inefficace puisqu'un trop grand nombre le protéines semblent avoir de l'affinité pour l'ATP