Estudio de propiedades físicoquímicas de matrices de hidrogel y de su interacción con biomoléculas para el desarrollo de biosensores

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2018I. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN 12 II. CAPÍTULO II: FUNDAMENTOS TEÓRICOS 18 II.1 BIOSENSORES 18 II.1.1 BIOSENSORES AMPEROMÉTRICOS ENZIMÁTICOS 19 II.2 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS 25 II.2.1 TIPOS DE INMOVILIZACIÓN 26 Atrapamiento 27 Encapsulamiento 27 Adsorción 27 Unión covalente 28 II.2.2 GRUPOS FUNCIONALES EN LAS ENZIMAS 28 Cadenas laterales de aminoácidos 29 Grupos funcionales sintéticos 29 II.2.3 MATERIALES DE SOPORTE 30 II.3 EFECTO DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA 31 II.3.1 EFECTO DEL MICROAMBIENTE 31 Efecto de la partición 32 Efecto de la difusión 33 II.3.2 EFECTO SOBRE LA ENZIMA 34 II.4 BIOSENSORES DESARROLLADOS EN ESTA TESIS 35 II.4.1 ANTECEDENTES DE BIOSENSORES CON GLUCOSA OXIDASA 36 II.4.2 ANTECEDENTES DE BIOSENSORES CON LACASA 38 II.5 CARACTERÍSTICAS DE LAS ENZIMAS UTILIZADAS 42 II.5.1 MECANISMOS ENZIMÁTICOS 42 Reacciones de sustrato único: Mecanismo de Michaelis – Menten 43 Mecanismo de ping pong para las enzimas rédox 46 II.5.2 GLUCOSA OXIDASA (EC 1.1.3.4) 48 II.5.3 LACASA (EC 1.10.3.2) 50 8 II.6 CARACTERÍSTICAS DE LOS COMPONENTES DEL SOPORTE DE INMOVILIZACIÓN 52 II.6.1 HIDROGELES: ESTRUCTURA Y PROPIEDADES 53 II.6.2 POLÍMEROS UTILIZADOS COMO SOPORTE ENZIMÁTICO 56 Mucina 56 Albúmina 58 Quitosán 60 Mezclas entrecruzadas con glutaraldehído 63 III. CAPÍTULO III: FUNDAMENTOS METODOLÓGICOS 66 III.1 TÉCNICAS ELECTROQUÍMICAS 66 III.1.1 CRONOAMPEROMETRÍA 68 III.2 ECUACIONES PARA SIMULAR LA RESPUESTA DEL BIOSENSOR DE GOX 73 Modelo matemático 74 III.3 MEDICIONES REOLÓGICAS 77 Sólidos ideales 78 Líquidos ideales 80 Materiales viscoelásticos 81 III.3.1 REOLOGÍA 81 III.4 HINCHAMIENTO 85 III.5 TRANSPORTE DE SOLUTOS A TRAVÉS DE LA MATRIZ POLIMÉRICA 87 IV. CAPÍTULO IV: MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES 90 IV.1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y MATERIALES 90 Soluciones buffer 90 Soluciones enzimáticas 91 Soluciones estándares de analito 91 Solución de entrecruzante 92 Preparación de los polímeros 92 IV.2 PREPARACIÓN DE ELECTRODOS ENZIMÁTICOS Y DISEÑO EXPERIMENTAL 92 Electrodos 94 Membranas permeoselectivas 94 9 IV.2.1 MATRIZ ENZIMÁTICA DE GLUCOSA 95 IV.2.2 MATRIZ ENZIMÁTICA DE LACASA 95 IV.2.3 PREPARACIÓN DE LOS ELECTRODOS ENZIMÁTICOS 95 IV.3 DETERMINACIONES REALIZADAS POR CRONOAMPEROMETRÍA 97 IV.3.1 CURVAS DE CALIBRACIÓN 97 IV.3.2 EFECTO DEL PH 97 IV.3.3 EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD 97 IV.3.4 MEDIDAS EN SUERO SANGUÍNEO Y ENSAYO DE RECUPERACIÓN 98 IV.4 ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS 99 IV.4.1 ÍNDICE DE HINCHAMIENTO 99 IV.4.2 COEFICIENTE DE PARTICIÓN 100 IV.4.3 COEFICIENTE DE DIFUSIÓN 100 IV.4.4 PERMEABILIDAD 102 IV.4.5 REOLOGÍA 103 V. CAPÍTULO V: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 104 V.1 DESARROLLO DEL BIOSENSOR PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA 104 V.1.1 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENTRECRUZANTE 104 V.1.2 EFECTO DE LA COMPOSICIÓN DE LA MATRIZ 107 Evaluación del intervalo lineal de la respuesta 109 Selección de la matriz para desarrollo analítico 111 V.1.3 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA 112 V.1.4 PROPIEDADES ANALÍTICAS 116 Reproducibilidad de sensor a sensor 116 Límite de detección e intervalo lineal 117 V.1.5 ESTABILIDAD DEL BIOSENSOR DE GLUCOSA 119 Diferencia en el tiempo de respuesta de acuerdo a la forma de almacenamiento 125 V.1.6 ANÁLISIS DE MUESTRAS REALES 131 V.2 DESARROLLO DEL BIOSENSOR PARA LA DETERMINACIÓN DE CATECOL 132 V.2.1 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENTRECRUZANTE 133 V.2.2 EFECTO DE LA COMPOSICIÓN DE LA MATRIZ 135 10 Evaluación del intervalo lineal de la respuesta 137 Selección de la matriz óptima para el desarrollo analítico 139 V.2.3 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LAC 139 V.2.4 EFECTO DE LA VARIACIÓN DEL PH DE LA SOLUCIÓN 141 V.2.5 PROPIEDADES ANALÍTICAS 142 Reproducibilidad de sensor a sensor 143 Límite de detección e intervalo lineal 144 V.2.6 ESTABILIDAD DEL BIOSENSOR DE CATECOL 145 V.3 DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS DE LAS MATRICES POLIMÉRICAS 147 V.3.1 DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE HINCHAMIENTO 148 V.3.2 COEFICIENTE DE PARTICIÓN DEL SOLUTO 150 V.3.3 ANÁLISIS DEL COEFICIENTE DE DIFUSIÓN 151 V.3.4 PERMEABILIDAD 153 V.3.5 PROPIEDADES REOLÓGICAS DE LAS MEZCLAS DE POLÍMEROS 154 Mezcla de mucina y albúmina 154 Mezcla de mucina y quitosán 157 Parámetros fisicoquímicos en función de propiedades reológicas 160 V.4 PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS Y DESEMPEÑO ANALÍTICO 162 V.4.1 BIOSENSOR DE GOX 163 V.4.2 BIOSENSOR DE LAC 167 V.5 SENSORES DE GLUCOSA, CATECOL, LACTATO Y OXALATO 171 VI. CONCLUSIONES GENERALES 178 VII. BIBLIOGRAFÍA 1842020-12-31Colombo, Lucas. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Garay, Fernando Sebastian. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Fisicoquímica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Fisicoquímica de Córdoba; Argentina.Baruzzi, Ana María. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Fisicoquímica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Fisicoquímica de Córdoba; Argentina.Fanani, María Laura. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.Lacconi, Gabriela Ines. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. 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