Avaliação da influência de fatores ambientais na expressão de genes de saxitoxina de cianobactérias

O trabalho apresentado nesta Dissertação de Mestrado foi realizado no Departamento de Saúde Ambiental do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, sob a coorientação da Mestre Carina Menezes e Doutora Elsa Dias.Dissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentados à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2019Orientadora Elisabete Valério, Departamento de Saúde Ambiental do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo JorgeAs cianobactérias são seres procariotas fotossintéticos com uma longa história evolutiva, o que possibilitou o desenvolvimento de várias características que permitem a sua adaptação perante as alterações climáticas e as modificações antropogénicas que se verificam nos sistemas aquáticos. Algumas cianobactérias, perante condições favoráveis, atingem elevadas densidades celulares originando os blooms. Este fenómeno está frequentemente associado à produção de toxinas. Dentro do grupo das cianotoxinas, a saxitoxina (STX) e os seus análogos têm ganho algum destaque uma vez que a sua ocorrência nos corpos de água doce representa um fenómeno mundial com um número crescente de casos nos últimos dez anos. A STX e os seus análogos são um grupo de alcalóides que são conhecidos por bloquear principalmente os canais de sódio das membranas dos axónios dos neurónios, afetando assim o sistema nervoso de vários animais, incluindo o Homem. Pode causar severas paralisias, levando inclusivé a uma falha respiratória, e consequentemente provocar a morte. Estas toxinas são produzidas por uma via biossintética única, sendo o cluster sxt responsável por codificar as proteínas que permitem a síntese e o transporte das toxinas SXTs para o meio extracelular. A presença destas toxinas nos corpos de água representa uma ameaça para a saúde humana, para a estabilidade do ecossistema e economia em todo o mundo. Muitos estudos laboratoriais têm mostrado que vários fatores ambientais afetam de diferentes formas a síntese de STXs. Perante o atual contexto de aquecimento global, as temperaturas médias das águas estão a aumentar pelo que muitas cianobactérias estão a expandir a sua distribuição geográfica, especialmente algumas espécies produtoras de STXs. Neste contexto torna-se particularmente importante perceber de que modo a temperatura pode influenciar o crescimento de cianobactérias produtoras de STXs e a sua respetiva síntese. A nível molecular, os efeitos que a própria temperatura tem sobre os níveis de transcrição de genes pertencentes ao cluster sxt encontram-se ainda pouco elucidados, estando descritos apenas numa espécie. De modo a providenciar novos conhecimentos nesta área, este trabalho teve como objetivo avaliar a relação entre três temperaturas diferentes (10, 20 e 30 °C) e parâmetros relacionados com o crescimento [taxa de crescimento, densidade celular e formação de células especializadas (heterócitos e acinetos)], a produção de STXs, e os níveis de expressão de genes que permitem sua síntese (sxtA) e o transporte de SXTs (sxtM e sxtPer) em duas estirpes de cianobactérias, Aphanizomenon gracile LMECYA40 e Cuspidothrix issatschenkoi LMECYA31, isoladas em albufeiras portuguesas. Os resultados obtidos permitiram estabelecer, para ambas as estirpes, uma relação entre as taxas de crescimento e a temperatura, sendo que este primeiro parâmetro foi menor nas culturas que cresceram a 10 °C e maior a 20 °C. A 30 °C nenhuma das culturas de A. gracile LMECYA40 e C. issatschenkoi LMECYA31 cresceu. À temperatura de 20 °C, também se verificou que C. issatschenkoi LMECYA31 produziu duas vezes mais STXs totais (toxin quota cell) ao longo das fases do crescimento do que A. gracile LMECYA40. Em ambas as espécies, a maior produção de STXs ocorreu a 20 °C na fase exponencial final. Em A. gracile LMECYA40, a formação de um elevado número de heterócitos ocorreu nas fases antecedentes às fases de maior produção de SXTs totais. Detetou-se a formação de acinetos nas duas estirpes a 10 °C, e no que diz respeito a C. issatschenkoi LMECYA31, a formação de acinetos com grandes volumes coincidiu com uma menor produção de STXs. Os níveis de expressão génica de sxtM e sxtPer foram influenciados pela temperatura e pela fase de crescimento correspondente nas duas estirpes. De uma forma geral, os dados obtidos sugerem que há uma regulação positiva destes genes à temperatura de 10 °C que foi acompanhada por o aumento deCyanobacteria are photosynthetic prokaryotes with a long evolutionary history, which enabled them to adapt to climatic changes and more recently to anthropogenic modifications of aquatic environments. A few cyanobacterial species, under favorable conditions, form massive surface growths named ‘blooms’, which are often associated with the production of toxins. Within cyanotoxins, saxitoxin (STX) and its analogues have gained some prominence, since their occurrence in freshwater bodies represents a worldwide phenomenon with an increasing number of cases in the last ten years. Saxitoxins are a group of carbamate alkaloid that are known to inhibit the sodium ion channels affecting the nervous system in vertebrates, which cause severe paralyses with respiratory failure ultimately ending in death. They are produced by a unique biosynthetic pathway, where the cluster sxt is responsible for encoding proteins that allow the synthesis and export of STXs. The presence of these toxins in water bodies represents a significant threat to human health, ecosystems stability and economy all over the world. Given these concerns, several environmental factors have attracted attention due to their potential impact on bloom formation and in the production of STXs. Many laboratory studies have shown that various environmental factors affect STXs synthesis in different ways. In the current context of global warming, where the average water temperatures are rising, many cyanobacteria are expanding their geographical distribution, especially STXs-producing species. It becomes therefore imperative to understand how temperature can influence the growth of STXs-producing cyanobacteria and their synthesis. Moreover, the effects of temperature on the transcription levels of genes belonging to the sxt cluster are poorly understood, being currently only described in one species. The aim of this study was to access the influence of three different temperatures (10, 20 and 30 °C) on STXs production and transportation during the several growth phases, in two strains producers of STXs, Aphanizomenon gracile LMECYA40 and Cuspidothrix issatschenkoi LMECYA31, isolated from Portuguese freshwaters. The goal was to establish a relationship between several parameters such as growth, STXs production, production of specialized cells (heterocytes and akinetes) and expression levels of genes that allow synthesis (sxtA) and transport of SXTs (sxtM and sxtPer) in these two strains. The results obtained allowed to establish a relation between the growth rates and the temperature in both strains. Specifically, the growth rate was lower in the cultures that grew at 10 °C and higher at 20 °C. None of the two isolates grew at 30 °C. At 20 °C, C. issatschenkoi LMECYA31 produced twice the amount of total STXs (toxin quota cell) throughout the growth stages when compared to the A. gracile LMECYA40. In both species the highest STXs production occurred in the final exponential phase at the temperature of 20 °C. In A. gracile LMECYA40, the formation of a large number of heterocytes occurred in the phases preceding a higher production of total SXTs. Akinetes production was detected in both strains at 10 °C. In the case of C. issatschenkoi LMECYA31, the formation of akinetes with large volume was coincident with a lower production of STXs. The expression levels of sxtM and sxtPer genes were influenced by temperature and growth phase in both strains. Overall, the data obtained suggest an over-regulation of these genes at 10 °C which was accompanied by an increase in total STXs. This may imply a higher concentration of extracellular STXs. On the other hand, the highest gene expression occurred in the late growth phases (exponential and stationary). Therefore, it can be concluded that the temperature influenced all the parameters analyzed, although affecting differently the strains A. gracile LMECYA40 and C. issatschenkoi LMECYA31. The results obtained in this study may be incorporated into predictive models or employed in the development of new monitoring techniques to manage bloom development and STX production, thus minimizing potential risks for humans and animals.N/