Molecular and functional changes induced by amino acids restriction in pancreatic beta cells : apoptosis pathway and redox balance

Orientadores: Everardo Magalhães Carneiro, Mariana Sarto FigueiredoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A desnutrição ainda acomete milhares de pessoas em todo mundo e sabe-se que a má nutrição nas fases inicias da vida leva ao desequilíbrio no metabolismo glicêmico na vida adulta, como alterações na função das células beta pancreáticas, o que pode predispor o indivíduo ao desenvolvimento do Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2). Diante diso, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da desnutrição in vitro na função e viabilidade de células beta pancreáticas. Para isso, foi utilizado linhagem de células produtoras de insulina (INS1-E) provenientes de rato, expostas ao meio de cultura controle (100% de aminoácidos) ou restrição de aminoácidos (25% de aminoácidos) por 48 horas na tentativa de mimetizar in vitro os efeitos encontrados em modelos prévios de desnutrição. Foi observado que células submetidas à restrição de aminoácidos (grupo restrito) apresentaram diminuição na expressão gênica e secreção de insulina, além de redução nas proteínas relacionadas com a extrusão do grânulo de insulina (SNAP-25) e com o metabolismo de glicose (PKC) e aumento na expressão de marcadores de estresse de retículo endoplasmático (p-eIF2alfa, ATF4, XBP1) e da pAkt. Ainda, tanto a densidade mitocondrial, como o potencial de membrana mitocondrial foram menores no grupo restrito, assim como a expressão proteica dos complexos I e IV da cadeia transportadora de elétrons. Além disso, foi analisado o estado redox das células após o término do tratamento de restrição, observando-se menor produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), acompanhado pelo aumento na expressão proteica das enzimas antioxidantes superóxido dismutase 1 e 2. Adicionalmente, foi caracterizado aumento na razão Bax/Bcl-xL e dimuição no conteúdo proteico da Hsp70, contudo, sem alteração na taxa de apoptose celular. Ao investigar se a sobrevivência celular era dependente do aumento da pAkt observou-se que, embora o grupo restrito tenha apresentado maior taxa de apoptose após inibição da via PI3K/Akt com Wortmannin, esse aumento não foi devido, exclusivamente, ao aumento da produção de EROs. Diante desses resultados, observamos que o grupo restrito apresenta diversas alterações funcionais e moleculares que não estão, a princípio, levando a morte celular. Contudo, a inibição da via PI3K/Akt aumentou a taxa apoptose e a produção de superóxido, indicando uma possível participação dessa via na sobrevivência das células que passaram pela restrição de aminoácidosAbstract: Malnutrition still affects thousands of people worldwide, and it¿s known that nutrition in the early stages of life leads to changes in the glycemic metabolism of adulthood, such as changes in pancreatic beta cells function, which may predispose the development of type 2 Diabetes Mellitus. Therefore, this study aimed to evaluate the effects of in vitro malnutrition on the function and viability of pancreatic beta cells. For this, a rat pancreatic beta cell line (INS1-E) was used, it was maintained in control culture medium (100% amino acids) or in restriction medium (25% amino acids) for 48 hours in an attempt to mimic in vitro effects found in previous models of malnutrition. It was observed that cells subjected to amino acid restriction (restricted group) presented a reduction in insulin gene expression and insulin secretion, besides there were also reduced expression of proteins related to insulin granules extrusion (SNAP-25) and glucose metabolism (PKC) and increased expression of reticulum stress markers (p-eIF2alpha, ATF4, XBP1) and pAkt. Also, both mitochondrial density and membrane potential of the mitochondria were lower in the restricted group, as well as the protein content of complexes I and IV of the electron transport chain. Moreover, the redox balance of the cells was analyzed after the restriction treatment and showed a reduction in the reactive oxygen species (ROS) production, accompanied by an increase in protein expression of antioxidant enzymes superoxide dismutase 1 and 2. It was observed an increase in the Bax/Bcl-xL ratio and reduction in the protein content of Hsp70, but no changes in cell apoptosis rate. When investigating whether cell survival was dependent on the increase of pAkt protein expression, we observed that, although the restricted group showed higher rates of apoptosis after inhibition of PI3K/Akt pathway with Wortmannin, this increase was not due exclusively to the increase in the production of ROS. Given these results, we observed that, although the restricted group presents several functional and molecular changes, they are not, in principle, leading to cell death. However, the inhibition of the PI3K/Akt pathway increased the apoptosis rate and the production of superoxide, indicating possible participation of this pathway in the survival of cells that went through the amino acids restrictionMestradoFisiologiaMestra em Biologia Funcional e Molecular88882.329746/2019-01CAPE