Bioprospecção do potencial tecnológico, probiótico e avaliação da segurança de bactérias láticas endógenas de queijos artesanais brasileiros

Orientador: Anderson de Souza Sant'AnaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Os queijos artesanais brasileiros (QAB) apresentam características singulares que podem refletir a história, a cultura e o estilo de vida das comunidades tradicionais produtoras. A microbiota endógena destes queijos, constituída principalmente por bactérias láticas (BAL), atua nas reações bioquímicas precursoras de texturas, aromas e sabores distintos. O objetivo deste estudo foi estudar as propriedades tecnológicas e probióticas de BAL isoladas a partir de QAB produzidos nas 5 regiões do país. No primeiro capítulo são reportados resultados da avaliação do potencial tecnológico (taxa de acidificação, proteólise, lipólise, atividade antimicrobiana e crescimento em diferentes condições de pH, sais biliares e cloreto de sódio) de 1.002 cepas de BAL isoladas a partir de 578 amostras de QAB. Para isso foi realizado um screening de alta performance em microplacas de 96 poços e os dados analisados no software R. O intuito foi selecionar as melhores cepas (n=220) com potencial para aplicação em culturas lácteas. No segundo capítulo, são apresentados resultados sobre a ocorrência de cepas do gênero "Enterococcus" e aspectos relacionados à sua segurança e potencial aplicação como culturas lácteas, devido ao papel controverso deste gênero em alimentos. No terceiro capítulo, são apresentados resultados de testes relacionados à formação de aroma, textura e produção de antimicrobianos de origem proteica das 220 BAL selecionadas. No quarto capítulo são reportados os resultados dos testes de potencial probiótico das 220 BAL, avaliado por meio da resistência à condições encontradas no trato gastrointestinal (TGI), propriedades de adesão e presença de genes de virulência. Uma cepa de Lactobacillus plantarum (1QB77) foi escolhida e empregada na produção de microqueijos em co-cultura com coquetéis de cepas de Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus. O quinto capítulo reporta resultados sobre a aplicação do método de engenharia evolutiva (EV) para a cepa 1QB77 a fim de melhorar sua performance na etapa inicial de acidificação do leite. Os resultados mostraram uma grande diversidade de BAL com potencial tecnológico, pertencentes aos gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc e Pediococcus. A espécie de L plantarum foi a mais recorrente nos QAB, demonstrando grande heterogeneidade intra-espécie, de acordo com a região de isolamento. Houve associação entre algumas propriedades das BAL e a fonte de isolamento, como a produção de antimicrobianos de origem proteica ativos contra L. monocytogenes e os queijos Minas Artesanal e a produção de enzimas lipolíticas com os queijos do Marajó. A associação de métodos de screening de alto rendimento e análise multivariada proporcionou a seleção racional de um elevado número de cepas, agrupadas de acordo com seu potencial probiotico, biopreservativo ou como culturas adjuntas para potencial aplicação na produção de queijos, podendo contribuir para a segurança, qualidade e valorização de culturas regionais. O gênero "Enterococcus" foi considerado componente natural da microbiota de QAB, principalmente dos queijos Marajó, Coalho e Manteiga e 63% apresentaram potencial para aplicação como culturas iniciadoras e/ou biopreservadoras, devido a não produção de hemolisinas e sensibilidade a vancomicina. A cepa Lb. plantarum 1QB77 preencheu os principais critérios in vitro para avaliação de potencial probiótico, reduzindo em até 4 unidades logarítmicas a contagem dos patógenos testados ao longo da maturação dos microqueijos e após submissão às condições simuladas do TGI. O método de EV empregado para melhorar a performance da cepa Lb. plantarum 1QB77 aumentou em seis vezes a taxa de acidificação do leite das cepas evoluídas, em comparação com as parentais (não evoluídas), e aumentou em 90% a viabilidade desta cepa quando exposta à condições simuladas do TGI. O protocolo de produção de microqueijos (~ 190 mg) desenvolvido neste estudo apresentou resultados dentro dos apresentados na produção em larga escala (0,5-1 kg) para queijos de média umidade, configurando excelente alternativa para estudos envolvendo novas formulações, novas culturas, porém, com redução drática dos custos. Em suma, os QAB demonstraram ser excelentes fontes de bactérias láticas endógenas com potencial para serem aplicadas como culturas adjuntas ou biopreservativas na produção de produtos lácteosAbstract: Brazilian artisanal cheeses (BAC) have unique characteristics, which reflect the history, culture, and lifestyle of traditional producing communities. The endogenous microbiota of these cheeses is mainly composed of lactic acid bacteria (LAB). These microorganisms play a crucial role in biochemical reactions that precede different textures, aromas, and flavors. This study aimed to investigate the technological and probiotic properties of LAB isolated from BAC produced in the five regions of Brazil. Chapter one shows results about the technological potential (acidification rate, proteolysis, lipolysis, antimicrobial activity, and growth under different pH conditions, bile salts, and sodium chloride) of 1,002 BAL strains isolated from 578 samples of BAC. For this purpose, high-throughput screening was performed using 96-well microplates, and all data analyzed using software R. The best strains (n=220) were selected due to its potential to be applied in dairy cultures. Chapter two aimed to investigate the occurrence of Enterococcus sp. strains and to access its safety and potential application as dairy cultures, due to the controversial role of Enterococci sp. in food. In chapter three, properties related to diacetyl (related to flavor), exopolysaccharide (EPS) (related to texture), and antimicrobials (with protein origin) formation of selected LAB (n =220) was accessed. Chapter four focused on studying some probiotic properties of the same LAB strains (n=220), as resistance to conditions found in the gastrointestinal tract (GIT), analysis of adhesion, and presence of virulence genes. Besides, a strain of Lactobacillus plantarum (1QB77) was chosen and used as adjunct culture in the manufacturing of microcheeses, in co-culture with cocktails containing Listeria monocytogenes and enterotoxigenic Staphylococcus aureus strains, separately. The fifth chapter aimed to apply a method called evolutionary engineering (EV) (or adaptative engineering) in order to improve the performance of Lb. plantarum (1QB77) in the initial step of the cheese process (acidification of milk). The results showed a great diversity of LAB with technological potential belonging to Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, and Pediococcus genus. The Lb. plantarum species was the most recurrent in BAC, showing a great heterogeneity intra-species, according to cheese and region of isolation. There was an association between some properties of LAB and source of isolation, such as the production of antimicrobials with protein origin active against L. monocytogenes and Minas Artesanal cheeses and production of lipolytic enzymes with cheeses from Marajó. The association between high-performance screening methods and multivariate analysis provided a rational selection of a high number of strains, making it possible to group them according to their features in probiotic, biopreservative, and adjunct cultures, which may contribute to safety, quality and enhancement of regional cultures in the dairy process. The Enterococcus genus was considered a natural component of BAC microbiota, mainly in Marajó, Coalho, and Manteiga cheeses, and 63% had the potential for application as a starter or biopreservative cultures, due to the absence of hemolysins and susceptibility to vancomycin. Strain Lb. plantarum 1QB77 met the main in vitro criteria for the evaluation of probiotic potential being able to reduce counts of pathogens tested along microcheeses process by up to 4 logarithmic units from the whole process (22 days of ripening) after submission to the simulated conditions of the GIT. The EV method used to improve the performance of Lb. plantarum 1QB77 increased milk acidification rates of evolved strains in six times, compared to parental (non-evolved) strains, and increased the viability of evolved strains by 90% when exposed to simulated GIT conditions. The microcheese production protocol (~ 190 mg) developed in this study showed results within those presented in large scale production (~ 0.5-1 kg) for medium moisture cheeses, configuring an excellent alternative for studies involving new formulations, new cultures, but with a drastic reduction in costs. In short, BAC has proved to be an excellent source of endogenous lactic acid bacteria with high potential to be applied as an adjunct or biopreservative cultures in the production of dairy productsDoutoradoCiência de AlimentosDoutora em Ciência de Alimentos2015/25641-4; 2017/03899-5FAPES