Evaluation of endothelial barrier breakdown mechanisms induced by heme

Orientador: Erich Vinicius de PaulaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: É sabido que o heme extracelular livre ativa vários compartimentos da imunidade inata, atuando como um padrão molecular associado ao perigo (DAMP) ou alarmina, em doenças associadas à hemólise. Embora a interrupção regulada e localizada da barreira endotelial (BE) seja uma parte importante da ativação da imunidade inata, que permite que os leucócitos circulantes atinjam os tecidos inflamados, a perda de localização e/ou da regulação da integridade da BE pode levar a aumento da permeabilidade microvascular generalizado e a lesão tecidual secundária, como observado em choque séptico. Em camundongos, foi demonstrado que o heme livre causa quebra da BE (in vivo e em culturas de células endoteliais) e uma forma de lesão pulmonar aguda que se assemelha à Síndrome Torácica Aguda (STA), que é a complicação mais grave da anemia falciforme (AF). Embora os efeitos da quebra da BE pelo heme também tenham sido recentemente mostrados em culturas de células endoteliais humanas, até onde sabemos, nenhum estudo avaliou o efeito do soro de pacientes com AF na integridade da BE. Neste estudo, exploramos o efeito de heme e soro de pacientes com AF na integridade da BE usando monocamadas de células endoteliais humanas, em condições experimentais destinadas a mimetizar eventos que normalmente desencadeiam complicações agudas da AF como a STA. A integridade da BE foi avaliada em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) por método baseado na detecção elétrica de impedância celular (Electric Cell Impedance Sensing), na presença de heme, LPS e soro de pacientes com AF (n=20) ou voluntários saudáveis (n=10). O heme causou uma diminuição dose-dependente (de 20 a 100 µM) na resistência normalizada das monocamadas, consistente com a redução da integridade da BE. O LPS exerceu efeito aditivo com o heme em relação à redução da integridade da BE em HUVECs. O soro de pacientes com AF induziu uma diminuição transitória da resistência, não observada com o soro de voluntários saudáveis. A adição do heme ao soro de pacientes com AF foi capaz de induzir uma perda significativa da integridade da BE, indicando que os efeitos do heme sobre a BE também ocorrem na presença de soro. Curiosamente, este efeito não foi observado quando o heme foi adicionado ao soro de voluntários saudáveis. Nossos resultados apoiam o conceito de que o heme livre participa da patogênese da STA, ao agregar dados gerados com células humanas e com amostras de pacientes, e sugerem que o ambiente inflamatório, presente nos soros de pacientes com AF, seja necessário para esse efeito do hemeAbstract: Free extracellular heme has been shown to activate several compartments of innate immunity, acting as a danger-associated molecular pattern in diseases associated with hemolysis. Although localized endothelial barrier (EB) disruption is an important part of innate immunity activation, that allows circulating leukocytes to reach inflamed tissues, loss of localization and/or regulation of EB disruption can lead to widespread microvascular hyperpermeability and secondary tissue damage, such as observed in septic shock. In mice, free heme has been shown to cause EB disruption (both in vivo and in endothelial cell cultures), and a form of acute lung injury that closely resembles acute chest syndrome (ACS), the most severe complication of sickle cell disease (SCD). Although the barrier-disrupting effects of heme have also been recently shown in human endothelial cell cultures, to our knowledge no studies evaluated the effect of serum from patients with SCD in EB integrity. Here we explored the effect of heme and sera from SCD patients on EB integrity using human endothelial cell monolayers, in experimental conditions aimed to mimic events that normally trigger acute SCD complications such as ACS. EB integrity was assessed in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) by electric cell-substrate impedance sensing, in the presence of heme, LPS and sera from SCD patients (n=20) or healthy volunteers (n=10). Heme caused a dose-dependent (20 to 100 µM) decrease in transendothelial electrical resistance, consistent with EB disruption. LPS caused an additive effect with heme on EB integrity in HUVECs. Sera from SCD patients induced a transient resistance decrease not observed with serum from healthy volunteers. Finally, heme caused transient EB disruption even in the presence of human serum, but this effect could only be observed with SCD patients serum, but not healthy volunteers. Our results support the concept that free heme participates in the pathogenesis of ACS by providing data generated with human cells and patients sera, and suggest that the inflammatory milieu present in sera from SCD patients is necessary for this effect of hemeMestradoFisiopatologia MédicaMestra em Ciência