Nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des β-hémoglobinopathies

Le développement de stratégies thérapeutiques curatives pour les patients affectés de β-hémoglobinopathies, c’est à dire drépanocytose et β-thalassémies, fait face à une grande demande. En effet, un accès restreint à des donneurs compatibles limite l’unique thérapie définitive autorisée, la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Au cours de la première partie de cette thèse,nous avons optimisé une alternative thérapeutique,la transplantation autoloque de CSH corrigées par le biais de lentivirus (LV). Le développement de lentivirus exprimant la β-globine et l’amélioration des conditions de transduction des CSH a débouché sur de probants bénéfices cliniques pour les patients drépanocytaires et thalassémiques traités par cette approche dans le cadre d’essais cliniques récents. Malgré ces progrès majeurs,cette thérapie pourrait bénéficier d’améliorations. En effet,la correction de thalassémies majeures, dépendantes de transfusion, ainsi que de la drépanocytose requiert de forts niveaux d’expression du transgène. Le but de ce projet est de choisir un LV à titre élevé, capable de transduire une large portion de CSH et d’entraîner une forte expression du transgène dans des globules rouges (GR) dérivés de CSH. A cet effet, nous avons comparé différentes combinaisons d’éléments régulateurs afin de définir la cassette régulatrice minimale nécessaire pour l’obtention de forts niveaux d’expression de la β-globine. Nous avons construit 2 mini-LCRs contenant soit HS2 et HS3 (taille totale 2.6 kb) ou HS2, HS3 et HS4 (taille totale 3.7 kb) provenant du Locus Control Region (LCR). Ces cassettes ont été insérées dans les LV β-AS3 et β-AS3 HS4, respectivement, qui contrôlent l’expression d’une globine anti-falciformante, βAS3-globine.Premièrement, nous avons comparativement évalué l’efficacité de transduction des vecteurs β-AS3 et β-AS3 HS4 dans des cellules souches progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) drépanocytaires et dans des CSH drépanocytaires. Le deuxième volet de cette étude a permis de déterminer l’expression de la βAS3-globine issue de ces deux constructions dans des GR dérivés de CSPH drépanocytaires, et d’évaluer l’efficacité du LV le plus efficace pour secourir le phénotype drépanocytaire.La seconde partie de cette thèse vise à développer une nouvelle stratégie thérapeutique par édition du génome pour réactiver l’hémoglobine fœtale (HbF). Cette approche s’appuie sur l’observation d’une meilleure évolution clinique des β-thalassémies et de la drépanocytose en présence de niveaux élevés d’HbF.Par l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9, nous avons invalidé les sites de liaisons de répresseurs transcriptionnels au niveau des promoteurs de la γ-globine pour réactiver l’expression de l’HbF dans des GR dérivés de CSPH drépanocytaires. La réactivation des gènes de γ-globine fœtale dans leur locus génomique endogène permet de s’affranchir des difficultés liées à l’expression relativement faible de transgène par copie de LV, principalement lié à la faible capacité des LV qui ne permet d’insérer que de courts fragments d’ADN du LCR, arrangés de manière non-physiologique. De plus,cette stratégie offre une approche potentiellement plus sûre comparée à une stratégie addition de gène basée sur l’usage de LV. Dans la drépanocytose, cette approche thérapeutique favorise l’expression de la γ-globine anti-falciformante aux dépens de la globine βS-globine mutée. Dans le cadre d’une approche comparative,nous avons évalué des cibles thérapeutiques connues et nouvelles au niveau des promoteurs de la γ-globine. A cet effet, plusieurs ARN guides (ARNg) ont été designés pour cibler 3 régions des promoteurs de la γ-globine, où des variants associés à des niveaux élevés d’HbF et/ou à des sites de liaison de répresseurs de l’HbF ont été décrits.Highly efficient curative therapeutic strategies are in great demand for patients affected by β-hemoglobinopathies, namely sickle cell disease (SCD) and β-thalassemia. Indeed, the poor access to compatible donors restrains the application of the only approved definitive therapy, the allogeneic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation. In the first part of this thesis, we aimed at optimizing an established therapeutic alternative consisting in the autologous transplantation of lentivirus (LV)-corrected hematopoietic HSCs. The development of β-globin expressing LVs and the improvement of HSC transduction conditions have led to a clear clinical benefit for SCD and β-thalassemia patients treated with this approach in the frame of recent clinical trials. Despite these significant progresses, there is room for further improvement. Indeed, the correction of severe transfusion-dependent B-thalassemia and SCD patients requires high levels of transgene expression. The goal of this project was to select a high-titer LV able to transduce efficiently HSCs and to drive high levels of transgene expression in HSC-derived RBCs. To this purpose, we compared different combinations of regulatory elements, in order to define the minimal regulatory cassette needed for achieving high levels of globin expression in the frame of LVs. We constructed 2 mini-LCRs containing either HS2 and HS3 (total size 2.6 kb) or HS2, HS3 and HS4 (total size 3.7 kb) derived from the 16-kb Locus Control Region. These cassettes were inserted in the β-AS3 and β-AS3 HS4 LVs, respectively, driving the expression of an anti-sickling βAS3-globin transgene. First, we aimed at comparatively evaluate the transduction efficiency of β-AS3 and β-AS3 HS4 in SCD hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) and long term-repopulating HSCs. The second aim of the study was to assess β-AS3 and β-AS3 HS4 derived transgene expression in RBCs produced from SCD HSPCs, and to evaluate the efficacy of the best-performing LV in rescuing the SCD phenotype. The second part of this thesis aimed to develop a novel genome editing-based strategy to restore fetal γ-globin genes expression. This therapeutic approach stems from the observation that the clinical course of β-thalassemia and SCD is improved in the presence of elevated HbF levels. By using the innovative CRISPR/Cas9 technology, we aimed at disrupting repressors binding sites in the γ-globin promoters to reactivate HbF expression in SCD HSPCs-derived RBCs. Reactivating fetal γ-globin genes at their endogenous genomic locus can circumvent the difficulties associated with the relatively low LV-derived transgene expression per vector copy, likely because the low LV vector capacity allows the usage only of short DNA stretches from the LCR, arranged in a non-physiological manner. In addition, this strategy offers a potentially safer targeted approach compared to the LV-based gene addition. In SCD, this therapeutic approach can favor the anti-sickling γ-globin expression, at the expense of the mutated βS-globin, given the competition between the fetal and the adult genes for the interaction with the LCR. In a comparative approach, we intended to evaluate novel and known therapeutic targets in the γ-globin promoters. To this purpose, several gRNAs have been designed to target 3 regions of the γ-globin promoters, where variants associated with elevated HbF levels and/or binding sites for HbF repressors have been described. We aimed to screen these gRNAs in an adult erythroid cell line (HUDEP-2) and SCD HSPCs-derived RBCs in terms of HbF reactivation and correction of the patient phenotype, to select the best therapeutic target for an efficient and safe therapeutic approach for β-hemoglobinopathies