Mécanismes génétiques et épigénétiques de la régulation de l’auto-renouvèlement des cellules souches embryonnaires de souris par le facteur de pluripotence Nanog

Durant son développement précoce et avant son implantation au sein de la paroi utérine, l'embryon de souris possède une population de cellules capables de générer tous les tissus nécessaires à la génération du futur fœtus, on dit qu'elles sont pluripotentes. Ces cellules sont rassemblées dans la masse cellulaire interne du blastocyste et peuvent s'auto-renouveler de façon apparemment infinie lorsqu'elles sont dérivées in vitro en cellules souches embryonnaires (ES). La pertinence de l'étude des cellules ES a été démontré par leur caractérisation qui a conduit à la mise au point de protocoles dits de "reprogrammation cellulaire" permettant de reconvertir des cellules somatiques différenciées dans un état pluripotent. Ceci constitue un espoir majeur pour la médecine régénérative. Le travail de ma thèse s'est centré sur l'étude du facteur de transcription (FT) Nanog qui est reconnu comme un régulateur central de l'auto-renouvèlement des cellules ES murines. Nous avons pu avancer dans la caractérisation des mécanismes moléculaires à la base de la fonction régulatrice de Nanog en interaction avec les autres FT dits "de pluripotence". Ce travail a permis de révéler les différentes modalités d'action de ce facteur lui permettant de médié ses fonctions activatrices et répressives à l'échelle du génome entier. Une étude transcriptomique a également permis de mettre à jour des centaines de long ARN non-codants finement régulés par Nanog et dont l'expression est corrélée à l'autorenouvèlement des cellules ES. Ce travail a aussi été accompagné par la mise au point et l’utilisation d’une lignée de cellules ES possédant le système d’activation de la transcription par CRISPR (CRISPRa).Mouse embryonic stem (ES) cells are derived from the pre-implantation blastocyst and are able to maintain pluripotency through limitless cell divisions in vitro. The study of the specific features of ES cells led to the discovery of the transcription factors (TFs) governing their unique transcriptome. Among those TFs, Nanog plays a central role in supporting ES cells self-renewal. Yet, the molecular mechanisms by which Nanog exerts its functions are not fully elucidated. We adapted an inducible CRISPR activation (CRISPRa) system in mouse ES cells and demonstrated its functionality to activate endogenous loci. We determined the list of Nanog responsive genes using gain (CRISPRa) and loss of function experiments. The DNA binding profiles of distinct pluripotency TFs were assessed genome-wide upon Nanog depletion and revealed its importance in the regulation of the pluripotency network activity at thousands of loci where it employs different mechanisms to activate and repress its targets. We expanded the list of Nanog responsive genes in the absence of LIF and found that Nanog-dependent repression is strongly correlated with H3K27me3 enrichment at target loci such as Otx2, a key differentiation factor. We then explored the regulation of long non-coding RNAs expression by Nanog and selected candidates that could potentially be involved in the maintenance of ES cell self-renewal. One of them already gave promising results. Finally, a fortuitous off-target effect of CRISPRa led to the induction of the 2C-like state spontaneously found in a subset of ES cells. Off-target binding sites were determined genome-wide and candidate genes are now under investigation