Regulation of HDAC1 expression and activity in haploid human tumor cells

Epigenetische Modifikationen an der DNA und den Histon-Proteinen verändern die Zugänglichkeit unserer Gene und damit auch deren Expression. Posttranslationale Modifikationen von Histon-Proteinen stellen einen der zentralen epigenetischen Kontrollmechanismen dar. Histondeacetylasen (HDACs) entfernen als zelluläre Gegenspieler der Histonacetyltransferasen (HATs), die Acetylgruppen von Histonen. Durch die dynamische Regulierung des Histon-Acetylierungsmusters kann die Transkriptionsfähigkeit von Genen gesteuert werden. Dadurch sind Histondeacetylasen entscheidend an diversen zellulären Prozessen beteiligt. Vor allem die Klasse-I-Enzyme HDAC1 und HDAC2, die den größten Anteil zur zellulären Histondeacetylaseaktivität beitragen, spielen eine zentrale Rolle in der Genexpression, Differenzierung und Zellproliferation, aber auch in der Karzinogenese. HDAC1 und HDAC2 zeigen eine hohe Sequenzhomologie und teils überlappende sowie isoform-spezifische Funktionen. Ihre volle enzymatische Aktivität ist von der Integration in Multiproteinkomplexe abhängig und kann dadurch sowie durch unterschiedliche posttranslationale Modifikationen (PTMs) reguliert werden. Insgesamt stellt die Regulierung durch Histondeacetylasen ein hochkomplexes System dar. Die Hypothese der modulierenden Wirkung von Histondeacetylasen in der Karzinogenese hat zur Entwicklung von HDAC-Inhibitoren geführt. Allerdings sind die meisten HDAC-Inhibitoren nicht isoform-spezifisch und auch dadurch mit zahlreichen Nebenwirkungen behaftet, die ihre klinische Verwendung einschränken. Daher ist die Erforschung der einzelnen HDAC-Isoformen und deren Regulierung im menschlichen Organismus von großer Bedeutung. Diese Arbeit war Teil eines Gesamtprojekts, in dem der Einfluss der enzymatischen Aktivität von Klasse-I-Deacetylasen auf die Genregulation und Proliferation von menschlichen Tumorzellen untersucht wird. Meine Arbeit hatte drei konkrete Ziele. Ersteres galt der Klonierung der katalytisch inaktiven Mutante HDAC2_142A, um eine stabile Transfektion in haploide humane Tumorzellen (HAP1) für zukünftige Experimente zu ermöglichen. Der zweite Teil des Projektes fokussierte auf die Untersuchung der SUMOylierungsmutante von katalytisch inaktiven HDAC1_2S, um herauszufinden, ob der beeinträchtigte Phänotyp der Mutante durch die Fusion von SUMO-Proteinen gerettet werden kann. Letztes Ziel und zugleich Hauptteil sowie Grundfrage der Arbeit widmete sich der Untersuchung der Regulierung der Aktivität und Expression von HDAC1. Im Zuge dessen sollten Daten hinsichtlich einer vermuteten Ko-Regulierung von HDAC1 und HDAC2 gesammelt und erforscht werden, ob diese auf Protein- oder RNA-Level basiert. Wenige bisherige Studien fokussierten die HDAC-Regulierung, weshalb man sich vielversprechende Ergebnisse erhoffte, die durch Immundetektions- und Expressionsanalysen sowie HDAC-Aktivitätstests an verschiedenen HDAC1/HDAC2 Knock-in- und Knock-out HAP1-Zelllinien generiert werden sollten, um unser generelles Verständnis über Histondeacetylasen zu erweitern.Class I histone deacetylases (HDACs), and HDAC1 and HDAC2 in particular, play a crucial role in transcription as well as in replication, splicing, DNA repair and cell cycle regulation. Histone deacetylases remove the acetyl groups added by histone acetyltransferases from lysine residues of histones, but also from several non-histone proteins. The deacetylation of histone proteins leads to a local condensation of the chromatin, affecting the accessibility and expression profiles of genes. By dynamically altering the histone acetylation pattern, the transcription of genes can be regulated. HDAC1 and HDAC2 show high sequence homology and have overlapping as well as isoform-specific functions. Their full enzymatic activity depends on their integration into multiprotein complexes as well as on different post-translational modifications (PTMs) and can thus be controlled. Overexpression of HDAC1 and HDAC2 has been observed in various cancer types. Due to the hypothesis of the modulating effect of HDACs in carcinogenesis, HDACs became attractive targets for cancer therapy affecting tumor proliferation through the block of angiogenesis and induction of cell cycle arrest and apoptosis. Unfortunately, most HDAC inhibitors are not isoform-specific. This might be one of the main reasons for adverse side effects limiting their use in clinical settings. Therefore, the research of the individual HDAC isoforms and their regulation in different cell types of the mammalian organism is of great importance. The aims of this project could be divided into three. The first was the cloning of the catalytically inactive mutant HDAC2_H142A to enable stable transfection into haploid human tumor cells (HAP1) for future experiments. The second part of the study focused on testing the effects of SUMOylation on the catalytic activity and co-repressor assembly of the enzymatically inactive HDAC1_2S in order to investigate whether the impaired activity of the mutant could be rescued by fusion of the SUMO proteins. The latter and main goal of the work was dedicated to the examination of the regulation of HDAC1 expression and activity. Data regarding a presumed co-regulation of HDAC1 and HDAC2 should be collected and investigated whether it is based on DNA or protein level. Only few previous studies concentrated on HDAC regulation. Therefore, one hoped for promising results to broaden our general knowledge about HDACs.Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersArbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüftMedizinische Universität Wien, Diplomarb., 2020(VLID)479021