Accumulation et assemblage des prolamines au cours du dévelloppement du grain de blé : approches microscopiques et protéomiques

Diplôme : Dr. d'UniversitéProlamins, wheat storage proteins, are involved in wheat end uses. These proteins are classified into gliadins, monomeric proteins, and glutenins, polymeric proteins linked by intermolecular disulfide bonds. The mature endosperm is characterized by a continuous matrix of proteins that surrounds starch. This matrix is the basis of the gluten network in the hydrated dough, which confers its cohesive and viscoelastic properties. Numerous data are available on prolamin sequences and in vitro structures of these proteins are partially described. Meanwhile, main processes of in vivo prolamin assembly and accumulation have not yet been characterized. The aim of this pH D work is: 1) to describe prolamin accumulation in endosperm cells during wheat seed maturation and their organization in storage bodies named protein bodies (PBs) 2) to identify the metabolic proteins that could be involved in prolamin assembly. For this purpose, two complementary approaches were used. First, the ontogeny of the protein bodies was analysed by fluorescence and electron microscopy from 7 to 43 days after anthesis (dAA), a period of time from the cellularization of endosperm to its desiccation. Protein bodies containing prolamins were observed as early as 7dAA. Later, around 15dAA, the PBs enlarged, and aggregation and/ or coalescence were prominent at 21dAA. From 33dAA, individual PBs were no longer visible, but a protein matrix was confined in the space between starch granules. All prolamins were found in the same protein bodies, without any segregation according to their types. Glutenin subunits and gliadins were observed in Golgi-derived vesicles at the early stages of endosperm development. In the same time, on the same samples, developmental and subcellular proteomic approaches were realized to characterize salino-soluble proteome variation of wheat endosperm and to identify all proteins of protein bodies.We identified many of the KCl-soluble proteins of endosperm varying during wheat grain filling with mass spectrometry. We obtained an overview of major processes taking place in the grain and how they changed during its development. The high proportion of stress and defense proteins was highlighted at the end of the endosperm maturation. Meanwhile, this study seems to be not adapted to identify proteins involved in prolamin assembly.Analyses of protein content of isolated PBs allow identifying chaperone proteins and proteases. Using all these results, we can hypotheses a role of PBs in prolamin storage, assembly and degradation.Les propriétés d’usage des blés reposent en grande partie sur la composition et les caractéristiques physicochimiques et fonctionnelles des prolamines, qui sont les protéines de réserve du grain. Ces dernières sont composées de gliadines monomériques et de gluténines polymériques, associations de sous-unités liées par des ponts disulfuress intermoléculaires. L’ensemble des prolamines constitue dans le grain mûr la matrice protéique, précurseur du gluten viscoélastique formé par hydratation et pétrissage dans les pâtes de farines de blé. De nombreuses données ont été accumulées sur les séquences des prolamines et leur structure in vitro commence à être partiellement connue. Cependant, la plupart des processus biologiques d’assemblage et d’organisation moléculaire et supra-moléculaire de ces protéines in planta sont encore ignorés. Les objectifs de ce travail de thèse sont 1) de décrire l’accumulation des prolamines dans les cellules de l’albumen au cours du développement du grain de blé ainsi que leur organisation dans les organites transitoires de stockage que sont les Corpuscules Protéiques (CPs). 2) d’identifier des protéines, qui pourraient être impliquées dans les mécanismes d’assemblage des protéines de réserve après leur biosynthèse. Pour mener à bien cette étude, deux approches complémentaires, basées sur des méthodologies différentes, ont été utilisées. En premier lieu, les outils de la microscopie ont été employés pour une caractérisation micro structurale et immunocytologique des grains de blé en développement et des CPs. Ces travaux ont permis de décrire l’évolution morphologique des CPs à l’intérieur des cellules de l’albumen tout au long du développement du grain de blé, des stades précoces de l’initiation de leur synthèse (7 Jours Après Anthèse) à leur disparition (33 JAA). Nous avons aussi pu montrer la co-localisation des différents types de prolamines dans ces organites. Enfin, l’observation de vésicules de petite taille et riches en prolamines à proximité de l’appareil de Golgi à des stades précoces de développement du grain de blé indique que cet organite est impliqué dans le routage des différents types de prolamines en début d’accumulation. En parallèle, sur les mêmes échantillons, des techniques de protéomique développementale et de protéomique sub-cellulaire ont été développées, afin de caractériser les variations du protéome salino-soluble de l’albumen de blé au cours de son développement, et d’identifier l’ensemble des protéines présentes dans les CPs. Les protéines salino-solubles, dont le niveau d’expression varie de façon significative au cours de la maturation du grain de blé, ont été analysées et identifiées par spectrométrie de masse. Ces protéines ont été mises en relation avec les différents métabolismes s’enchaînant au cours du développement du grain. La forte proportion en fin de maturation de protéines de défense et liées aux stress a été soulignée. Cette approche à l’échelle de l’albumen n’est cependant pas apparue comme la mieux adaptée à l’identification des protéines candidates d’intérêt. L’analyse des protéines présentes dans les CPs, après isolement de ceux-ci, a abouti à l’identification de protéines de type chaperon et de protéines à activité protéasique. Cela nous a permis de formuler une hypothèse sur le rôle de ces organites dans l’accumulation, l’assemblage et la dégradation des prolamines