The cytotoxicity of selected isoquinoline alkaloids by apoptosis induction

Tato diplomová práce se zabývá vlivem vybraných devíti isochinolinových alkaloidů čeledi Papaveraceae a Fumariaceae na viabilitu, proliferaci a indukci apoptózy u nádorových buněčných liniích A549, Jurkat a MOLT-4. Nejprve se provedl screening cytotoxicity a antiproliferační aktivity isochinolinových alkaloidů pomocí xCELLigence na buňkách adenokarcinomu plic A549. Tato metoda zaznamenává změnu cell indexu v čase, odhalí tak potenciálně časné i pozdní cytotoxické a antiproliferační působení testovaných látek. Pomocí screeningu bylo zjištěno, že pouze dvě látky vykazovaly cytotoxickou a antiproliferační aktivitu a to chelidonin a homochelidonin. Cytoxická aktivita zprostředkovaná indukcí apoptózy a antiproliferační aktivita zprostředkovaná zástavou buněčného cyklu byla dále analyzována po působení chelidoninu a homochelidoninu u p53-deficientních (Jurkat) a p53-exprimujicích (MOLT-4) T-leukemických buněk. Nejprve se stanovila viabilita a proliferace použitím Trypanové modři a metodou kvantifikace aktivity mitochondriálních dehydrogenáz buňky. S využitím průtokové cytometrie byla detekována změna distribuce buněčné populace v jednotlivých fázích buněčného cyklu podle obsahu DNA a indukce fosforylované formy histonu H3 na serinu 10. Průtokovou cytometrii jsme dále kvantifikovali vazbu Annexinu V a propidium jodidu pro stanovení procenta buněk v apoptóze. Závěrem byla pomocí fluorescenčního mikroskopu pozorována aktivita kaspáz 3/7 po ovlivnění chelidoninem a homochelidoninem u buněk A549. Závěrem lze shrnout, že alkaloidy chelidonin a homochelidonin účinně snižovaly viabilitu, proliferaci a vedly k indukci apoptózy u testovaných buněčných linií. Expozice chelidoninu vedla k akumulaci buněk Jurkat a MOLT-4 v G2 fázi buněčného cyklu nezávisle na dávce. Aplikace homochelidoninu vedla k dávkově závislé akumulaci buněk Jurkat v G2 fázi buněčného cyklu. Naopak u buněk MOLT-4 vedly nižší koncentrace k akumulaci buněk v G1 (5 a 10 ?mol/l) a vyšší koncentrace v G2 fázi buněčného cyklu (10 a 20 ?mol/l). Expozice testovaným alkaloidům byla asociovaná s částečnou zástavou buněk v mitóze. U buněk Jurkat se vyskytovalo vyšší procento apoptických buněk než u buněk MOLT-4.This thesis describes the effect of nine isoquinoline alkaloids of Papaveraceae and Fumariaceae plat family on cells viability, proliferation and induction of apoptosis in tumor cell lines A549, Jurkat and MOLT-4. We screened cytotoxicity and antiproliferative activity using xCELLigence RTCA system against adherent lung adenocarcinoma A549 cells. This method measures the change of cell index during the time after exposure, therefore it reveals potentially early or late cytotoxic effects and antiproliferative activities. Employing screening method we determined that only two compound showed cytotoxic and antiproliferative activity, the chelidonine and the homochelidonine. Cytotoxic activity mediated through apoptosis induction and antiproliferative activity mediated through cycle arrest were analyzed employing p53 deficient (Jurkat) and p53 wild-type (MOLT-4) T-leukemic cells after chelidonine and homochelidonine treatment. We determined cell viability and proliferation using Trypan blue staining method and via quantification of mitochondrial dehydrogenase activity of cells. Using flow cytomery we assessed changes in cell cycle phase distribution according to DNA content and induction of phosphorylated form of histone H3 at serine 10 in cells. Using flow cytometry we further quantified binding of Annexin V and propidium iodide to determine percentage of cells in apoptosis. Finally we visually observed caspase 3/7 activity using fluorescence microscopy after chelidonine and homochelidonine treatment in A549 cells. We can conclude that alkaloids chelidonine and homochelidonine effectively decreased viability and proliferation and lead to apoptosis induction in examined cell lines. Exposure to chelidonine accumulated Jurkat and MOLT-4 cells in the G2 phase of the cell cycle independently on the dose applied. Application of homochelidonine lead to dose-dependent accumulation of Jurkat cells in G2 phase of the cell cycle. Inversely, in MOLT-4 cells at lower concentrations (5 a 10 ?M) lead to accumulation of cells in G1 and at higher concentrations (15 and 20 ?M) lead to accumulation of cells in G2 phase of the cell cycle. Exposure to examined alkaloids was associated with partial arrest of cells in mitosis. Jurkat cells showed higher percentage of apoptotic cells when compared with MOLT-4 cells.Katedra biologických a biochemických věd1.Prezentace výsledků diplomové práce. 2. Přečtení posudků vedoucího a oponenta diplomové práce. 3. Diskuze k posudkům vedoucího a oponenta diplomové práce. 4. Studentka odpovídala na vaechny dotazy a připomínky k DP