Micropropagação e caracterização da comunidade endofítica de Plinia spp

Orientadora: Prof. Drª. Marguerite Germaine Ghislaine QuoirinCoorientadores: Drª. Juliana Degenhardt-Goldbach e Drª. Krisle da SilvaDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Botânica. Defesa : Curitiba, 26/09/2019Inclui referênciasResumo: Este trabalho teve como objetivos desenvolver um protocolo de micropropagação por multiplicação de gemas axilares para as espécies de jabuticabeira Plinia peruviana, Plinia cauliflora var. paulista e var. sabará iniciando pelo estabelecimento de um protocolo de germinação de sementes in vitro; investigar a comunidade endofítica associada a tecidos cultivados in vitro e folhas de plantas in situ de Plinia peruviana. Foi estudado o efeito dos meios de cultura WPM, WPM/2, MS e MS/2 na germinação de sementes de Plinia peruviana e Plinia cauliflora var. paulista, o efeito da concentração de Plant Preservative Mixture™ (PPM™) (0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 16,0 ml.L-1) na inibição de crescimento de microrganismos, o efeito da ausência de nutrientes e presença de carvão ativado e polivinilpirrolidona-40 (1 ou 3 g.L-1) no meio de germinação de sementes de Plinia cauliflora var. sabará. Para a etapa de indução de brotos, foram testadas as citocininas 6-benzilaminopurina (0; 2,22; 4,44; 6,66; 8,88 ?M) para as três jabuticabeiras e cinetina (0; 2,33; 4,65; 6,97; 9,30 ?M na presença ou ausência de 1 g.L-1 de carvão ativado (CA)) para Plinia cauliflora var. sabará. Segmentos nodais cultivados in vitro e folhas do campo foram usados para o isolamento de bactérias endofíticas. Os isolados foram testados com relação a produção de compostos indólicos, na promoção da germinação de sementes de jabuticabeira in vitro e acerca da sensibilidade a antibióticos. Nos meios WPM e MS/2, as sementes apresentaram taxa de germinação de 40%, significativamente maior que no meio MS. A adição de 3 g.L-1 de CA causou aumento da germinação (95%), redução da oxidação do meio (20%), aumento do tamanho da parte aérea (6,18 cm) e do índice de velocidade de germinação (IVG) em relação ao meio sem adição de CA. O PPM™ foi eficiente no controle de microrganismos endofíticos na concentração de 1,0 ml.L-1. A adição de BAP em concentração de 4,4 ?M resultou em maior multiplicação e tamanho médio de brotos para as espécies Plinia peruviana (taxa de 1,88 em dois meses e brotos de 6,50 mm) e Plinia cauliflora var. paulista (taxa de 2,43 em dois meses e brotos de 10,53 mm). As citocininas testadas não afetaram a taxa de multiplicação da espécie Plinia cauliflora var. sabará; na presença de CA e todas as variáveis apresentaram menores médias em comparação com a sua ausência. Foram isoladas 65 bactérias, 11 a partir de segmentos nodais e 54 de folhas. Todas as bactérias avaliadas produziram compostos indólicos na ausência do triptofano; entre as maiores produtoras foram identificados os gêneros Bacillus, Pseudomonas e Stenotrophomonas por meio do sequenciamento do gene rRNA 16S. A inoculação de bactérias isoladas em sementes de jabuticaba causou aumento na taxa de germinação e índice de velocidade de germinação (IVG): 97% e IVG 1,35 (Stenotrophomonas spp.); 85,34% e IVG 1,21 (Bacillus spp.); contra 74,67% e IVG 0,86 do controle. A estirpe Ab-V6 de Azospirillum brasiliense usada como referência aumentou o tamanho médio das raízes. Amoxicilina, cloranfenicol, estreptomicina e levofloxacina inibiram o crescimento de isolados obtidos das culturas in vitro. Em conclusão, foi desenvolvido um protocolo eficiente de germinação in vitro, porém, a multiplicação das jabuticabeiras é baixa e ocorre de forma lenta. Além disso, as bactérias endofíticas revelaram capacidade de promoção do crescimento das plântulas de Plinia peruviana obtidas de sementes germinadas in vitro. Palavras-chave: bactérias endofíticas; cultura de tecidos; jabuticaba de cabinho; jabuticaba paulista; jabuticaba sabará; Plant preservative Mixture™; rRNA 16S.Abstract: This work aimed at initiating a micropropagation protocol by axillary bud multiplication for Plinia peruviana, Plinia cauliflora var. paulista and sabará, starting with the in vitro seed germination protocol, and investigating the endophytic community associated with in vitro cultured tissues and a field plant of Plinia peruviana. During the in vitro germination, the effect of the following factors was evaluated: culture media composition (WPM, WPM/2, MS and MS/2) with seeds of Plinia peruviana and Plinia cauliflora var. paulista, Plant Preservative Mixture™ (PPM™) (0; 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 8.0; 16.0 ml.L-1) as biocide and the absence of nutrients in the culture medium and presence of activated charcoal and polyvinylpyrrolidone-40 (1 or 3 g.L-1) with seeds of Plinia cauliflora var. sabará. For the bud induction step the effect of 6- benzylaminopurine (0, 2.22; 4.44; 6.66; 8.88 ?M) was tested for the three species and kinetin (0, 2.33; 4, 65, 6.97, 9.30 ?M, in the presence or absence of 1 g.L-1 activated charcoal (AC)) for Plinia cauliflora var. sabará. In vitro cultivated nodal segments and leaves from field trees were used for the isolation of endophytic bacteria. The isolates were tested for the production of indole compounds, for the promotion of the in vitro germination of jabuticaba seeds and for its antibiotic sensitivity. In WPM and M/2 culture media, the germination rate was 40%, significantly higher than in MS medium, and the other variables did not vary significantly. The addiction of AC at 3 g.L-1 caused increased germination rate (95%), reduced oxidation of the medium (20%), increased shoot size (6.18 cm) and germination speed when compared to the medium without AC. PPM™ was efficient in controlling endophytic microorganisms at a concentration of 1.0 ml.L-1. The addition of BAP at 4.4 ?M resulted in increased multiplication rates and shoot size for Plinia peruviana (rate of 1.88 in two months and size of 6.50 mm) and Plinia cauliflora var. paulista (rate of 2.43 in two months and size of 10.53 mm). The cytokinins tested did not affect the multiplication rate of Plinia cauliflora var. sabará. When AC was added to the culture medium, all variables presented lower means than in its absence. Sixty-five bacteria were isolated, 11 from nodal segments and 54 from leaves. All bacteria evaluated produced indolic compounds in the absence of tryptophan. Among the major producers that were identified by sequencing the 16S rRNA gene are the genera Bacillus, Pseudomonas and Stenotrophomonas. Inoculation of isolated bacteria in jabuticaba seeds caused an increase in germination rate and germination speed (GS): 97% and IVG 1.35 (Stenotrophomonas spp.); 85.34% and IVG 1.21 (Bacillus spp.); against 74.67% and IVG 0.86 of the control. The reference Ab-V6 strain of Azospirillum brasilense promoted the root growth. Amoxicillin, chloramphenicol, streptomycin and levofloxacin inhibited the growth of isolates obtained from in vitro cultures. In conclusion, an efficient protocol was developed for in vitro germination but the in vitro multiplication of jabuticaba trees is low and occurs slowly. Furthermore, the endophytic bacteria revealed their capacity to promote growth of Plinia peruviana seedlings obtained from in vitro germinated seeds. Keywords: endophytic bacteria; jabuticaba de cabinho; jabuticaba paulista; jabuticaba sabará; Plant preservative Mixture™; tissue culture; 16S rRNA