Technical advances in mass spectrometry-based proteomics and its application to the characterisation of glioma-initiating cells

Der derzeit klassische Ablauf einer Peptid/Protein Identifikation mittels Flüssigkeitschromatography mit gekoppeltem Massenspektrometer (LC-MS) beruht auf Masse, Ladung und Fragmentierung der Peptide. In dieser Doktorarbeit wende ich diese Technik zur Charakterisierung von zellulären Proteomen an, um Gliomstammzellen und neuronale Stammzellen zu analysieren um so Einblicke in die Krebssignatur der frühen Zellarten zu erhalten. Parallel untersuche ich in proteomischen Arbeitsabläufen Verbesserungen durch bessere Ausnutzung von experimentellen Parametern, die in proteomischen Experimenten auftreten. Besonders die Isotopenverteilungen von Peptiden wird generell nicht in proteomischen Methoden verwendet, obwohl sie in jedem akquirierten Spektrum enthalen sind. Daher untersuchten wir die Verwendung von Isotopenmustern in MS1 Massenspektren, um die Peptididentifikation zu unterstützen. Wir belegten, dass der relative Isotopenhäufigkeits (RIA)-Fehler 4-5% beträgt und dieser nur gering von Spektrumintensität, Auflösung und Anzahl an MS1 Spektren abhängt. In kompletten Proteomanalysen hat die derzeitige RIA-Genauigkeit eine limitierende Trennschärfe. Mit einherging, dass die Analyse durch die Schwierigkeit der FDR Berechnung beeinträchtigt wurde, insbesonders bei der Erstellung richtiger Zufallsdatenbanken, die ähnlich in der Größe aber unterschiedlich in der molekularen Zusammensetzung aller enthaltener Peptide der Zieldatenbank sind. Alternative Strategien zur Berechnung der FDR werden vonnöten sein um dieses Problem in komplexen Proteomanalysen Herr zu werden. Trotzdem wird die Nützlichkeit von RIA mit künftigen instrumentellen Entwicklungen vielleicht relevant werden, wenn berücksichtigt wird dass eine nur geringe Senkung des RIA-Fehlers unter 1% eine starke Verbesserung der Trennschärfe bewirkt. Alternativ wäre mit Zunahme der Massengenauigkeit vielleicht sogar der derzeitige RIA Genauigkeitslevel ausreichend, um Isotopenmustern als Nebenbedingung in Peptididentifikationen einzubinden, da sie als Parameter „umsonst“ in jedem MS-basierden proteomischen Experiment vorhanden sind. Das Glioblastom ist der häufigste bösartigste Gehirntumor und es gibt starke Hinweise, dass Gehirntumore aus einer geringen Population von Zellen, bekannt als Krebsstammzellen (CSCs) erstehen. Der Tumor weist normale Stammzell-Charakteristika auf, wie langfristige Selbsterneuerung, Langlebigkeit und die Fähigkeit sich in adulte Zellen zu differenzieren. Um die Unterschiede der globalen Proteinexpression zwischen bösartigen neuralen Stammzellen, die aus adulten Gliomen (GNSs) entstehen und unveränderten, karyotypischen normalen fötalen neuronalen Stammzellen [1] zu lüften, erbrachten wir massenspektrometrische Analysen von beidem, dem totalen Zellproteom und dem sekretierten Proteom dieser Zellen. Dies resultierte in ~7500 und ~2000 quantifizierten Proteinen und 446 unterschiedlich exprimierten Proteinen (152 hoch- und 294 herunterreguliert in GNSs) beziehungsweise 167 unterschiedlich exprimierten Proteinen (144 hoch- und 23 herunterreguliert). Nach der Datenanalyse konnten mehrere Proteinkandidaten als Oberflächenmarker zwischen NSs und GNSs unterschieden und mittels Immunozytochemie validiert werden. Weiterhin wurden Kandidaten der GNS-sekretierten Faktoren, die eine tumorgenetische Veränderung der NSs vermitteln können, mittels Zeitraffer Aufnahmen und koloniebildende Assays evaluiert. Beide Experimente lieferten positive Ergebnisse, die die Bedeutung der Protoemics demonstiert. Allerdings sind weitere Experimente nötig, um diese Resultate zu festigen